基于CXCR4-FAK信號通路觀察鞘內注射右美托咪定改善大鼠脊髓缺血再灌注損傷后神經運動功能

秦 燕，楊 光

(1.成都體育學院附屬體育醫院，成都 610000；2.四川省骨科醫院，成都 610000)

脊髓缺血再灌注損傷(spinal ischemia reperfusion injury，SCIRI)在脊柱外科手術、血管畸形手術、胸主動脈瘤切除手術以及心臟手術體外循環期間中較為常見，具有潛在致殘、致死性[1]。SCIRI的發病機制尚不明確，但研究表明[2]氧化應激中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量蓄積導致的細胞凋亡，以及血-脊髓屏障(blood-spinal cord barrier，BSCB)結構的破壞是SCIRI的最重要的病理改變[3]。因此尋找有效的藥物或者治療手段降低SCIRI后細胞內的ROS含量，降低細胞的凋亡率，以及保護BSCB的完整性是當前脊髓損傷防治與再生修復中研究的熱點。右美托咪定是一種高選擇性的腎上腺受體激動劑。藥理研究表明[4]右美托咪定具有優良的鎮靜、抗焦慮和鎮痛的作用。研究證實[5]右美托咪定能夠在SCIRI中發揮抗氧化、抑制細胞凋亡等作用。CXC趨化因子受體4(CXC chemokine receptoR-4，CXCR4)/粘著斑激酶(focal adhesion kinase，FAK)信號是重要的內源性的氧化應激信號通路之一[6]。王麗萍等[7]研究表明CXCR4-FAK信號能促進骨髓間充質干細胞向大鼠SCIRI組織的遷移，增強其粘附能力，降低氧化應激，減少ROS的集聚，發揮對大鼠脊髓的保護作用。因此本研究構建大鼠SCIRI模型，探討右美托咪定通過CXCR4-FAK信號通路的調節對大鼠SCIRI的保護作用，從而為臨床提供新的數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10～12周齡的SPF級SD雄性大鼠共計60只，體重在220～250 g，由我院實驗動物實驗中心提供[SCXK(川)2018-211]；所有動物均在四川省實驗動物專委會養殖場SPF級動物房飼養[SYXK(川)2018-14]，室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養1周后用于試驗。動物的使用及實驗操作按照本院實驗動物管理委員會(IACUC-JY-2018-075)的規定執行。實驗過程中依照3R原則給予所有動物人道主義關懷。

1.2 主要試劑與儀器

鹽酸右美托咪定注射液(dexmedetomidine hydrochloride injection，DHI，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，生產批號為:國藥準字H20090248)；CXCR4激動劑Diprotin A(美國cell signal公司，批號∶A13074)。

伊文思藍(evans blue，EB)采購自Sigma公司，生產批號∶BCBL1305 V；TUNNEL試劑盒、DCFH-DA試劑盒購自美國Selleck公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB化學發光試劑盒采購自天津百浩鑫生物有限公司；CXCR4、p-FAK抗體采購自Santa公司；戊巴比妥鈉(德國進口分裝，250 g/瓶)、多聚甲醛(批號∶050406)、二甲苯(批號83090501)采購自美國PALL公司；冰凍切片包埋劑采購自美國櫻花公司；Western blot試劑盒購自美國abcam公司。

蘇凈Airtech超凈工作臺(北京六一儀器廠)；顯微鑷(型號∶15 cm 15 m/m)、顯微剪(型號∶Ⅲ14 cm)(浙江寧波醫用縫針廠)；Titan G2 60-300電鏡(美 國FEI公司)；組織包埋機(型號∶LEICAEG1150)(德國Leica公司)；Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡(型號∶H-7650)(日本三菱公司)；5810R型高速離心機(日本島津公司)；E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型構建和分組處理

將60只10～12周齡的SPF級SD雄性大鼠隨機分為4組(n＝15):假手術組(sham組)、模型組、右美托咪定組(DHI組)、CXCR4-FAK信號通路激動劑Diprotin A組(DPA組)。參照文獻制作大鼠SCIRI模型[8]:大鼠注射麻醉后，常規備皮、消毒，取右側臥位，固定在手術臺上，在肋緣行縱切口，在顯微鏡下使用顯微剪逐層分離，直至完全暴露大鼠左肺上葉，醫用無菌紗布將肺部保護后，從心包處開始分離胸主動脈，使用無創動脈夾在主動脈弓鎖骨上左動脈起始點處加閉15 min后，移除動脈夾，sham組不做加閉處理，常規無菌逐層縫合傷口，為防止感染術后需要尾靜脈注射0.2 mL氨芐青霉素(100 mg/mL)。構建動物模型成功后，每只大鼠單籠飼養，常規飼料，標準飲食喂養。DHI組、DPA組大鼠在造模前72 h鞘內分別注射DHI和Diprotin A，注射劑量30μL，濃度5μmol/L，sham組、模型組注射等量生理鹽水，每日定點注射1次，連續3 d。

1.3.2 各組大鼠下肢的神經運動功能評分

造模后第4天，采用改良的Tarlov評分方法評價各組大鼠下肢的運動功能[9]，評分標準為:0分:幾乎沒有可覺察額下肢活動；1分:大鼠有能被覺察的下肢關節自主活動；2分:大鼠的后肢能自由活動，但不能站立；3分:大鼠能站立，但不能行走；4分:大鼠后肢運動功能基本恢復，能正常行走。

1.3.3 伊文思藍(evans blue，EB)染色檢測各組大鼠BSCB的完整性

神經運動功能評價完畢后，在5 min內，尾靜脈勻速注射50 mL EB(10 mL/kg)。1 h后處死大鼠，常規無菌手段剝離大鼠的脊髓組織，并迅速轉移至深冷冰箱中。取大鼠的L4脊髓節段，采用4%多聚甲醛固定、15%、20%、30%蔗糖溶液沉糖，冰凍切片，在Nikon Ti-U/Ti-s倒置熒光顯微鏡下，每個切片選擇6個視野觀察BSCB的完整性并進行統計分析。

1.3.4 干濕法檢測各組大鼠脊髓的含水量

取出大鼠的L5脊髓節段，首先用濾紙吸干脊髓表明水分，稱取濕重(W)，放入恒溫烤箱中24 h，烤箱溫度維持在120℃，之后稱取干重(D)。大鼠脊髓含水量(%)＝(W-D)/D×100%。

1.3.5 電鏡觀察各組大鼠脊髓組織超微結構改變

取出大鼠的10% L6脊髓節段，制成超薄組織切片:采用2.5%聚甲醛預固定15 min，1%鋨酸固定20 min，無菌濾紙吸干水分，環氧樹脂(812)浸透包埋切片，以醋酸雙氧鈾(uranyl acetate)及枸櫞酸鉛(lead citrate)做雙重染色，制成50 nm切片，待切片完全干燥后載與銅網上，上透射電鏡觀察大鼠脊髓組織超微病理結構。

1.3.6 TUNEL染色檢測各組大鼠脊髓組織中的細胞凋亡

從冰箱中取出10% L6脊髓節段，常規方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗2次，梯度酒精浸洗5 min，風干后3%雙氧水-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，然后4℃預冷乙醇上進行如下操作:0.1% TRItonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，每次3 min，加入TUNNEL反應混合液，加封口膜在暗濕盒中反應1 h，溫度37℃，PBS漂洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，熒光顯微鏡進行觀察，每組切片6個不同的視野，并通過Image-Pro 6.2軟件處理圖像，統計分析大鼠脊髓組織細胞的凋亡率。

1.3.7 各組大鼠脊髓組織的氧化應激比較

取大鼠的20% L6脊髓節段，10%聚甲醛固定2 h，石蠟包埋并切片，用10μmol/L DCFH-DA染色2 h，熒光顯微鏡下拍照。按照各試劑盒說明書要求，使用MDA檢測試劑盒和SOD檢測試劑盒來檢測腹動脈組織中與氧化反應相關的底物變化水平。

1.3.8 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK的表達

取出大鼠的20% L6脊髓節段，研磨勻漿，加入100 mL RIPA裂解液，冰上超聲處理30 min后，離心獲得上清，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度，每個樣品取50μg，然后進行SDS-PAGE電泳、轉膜、加入封閉液4℃過夜孕育，然后分別加入一抗(1∶1500)，孕育1 h，洗滌加入抗辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(1∶10000)，DAB顯色，以GAPDH作為內參分析蛋白相對表達水平；每個樣品獨立重復3次。

1.4 統計學方法

數據分析采用軟件SPSS 16.0，符合正態分布的計量資料采用平均數±標準差(±s)表示，多組間的比較采用單因素方差分析，兩兩組間的比較采用獨立t檢驗，當P＜0.05表示具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經運動功能評分以及脊髓組織的含水量

如圖1所示，與sham組相比，模型組大鼠神經運動功能評分明顯降低(P＜0.05)，經藥物干預后，與模型組相比，DHI組、DPA組大鼠神經運動功能評分明顯升高(P＜0.05)，DHI組和DPA組相比，差異不明顯(P＞0.05)，無統計意義。

如圖2所示，與sham組相比，模型組大鼠的脊髓組織的含水量明顯升高(P＜0.05)，經藥物干預后，與模型組相比，DHI組、DPA組大鼠的脊髓組織的含水量明顯降低(P＜0.05)，DHI組和DPA組相比，差異不明顯(P＞0.05)，無統計意義。

2.2 EB染色檢測各組大鼠BSCB的完整性

注射伊文思藍(evans blue，EB)入血后能與白蛋白特異性結合，形成穩定的EB-白蛋白復合物。正常情況下，此復合物不能通過動物的血-腦和血-脊髓屏障，但是在血-腦和血-脊髓屏障結構被破壞后，才能滲出到神經組織中[10]，在熒光顯微鏡下，EB呈現鮮亮的紅色。本研究中EB染色結果如圖3所示，sham組大鼠未見紅色熒光，表明BSCB結構完整；與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織經EB染色后，可見紅色熒光強度明顯增強(P＜0.05)，并且主要位于脊髓灰質，說明模型組中BSCB結構的完整性已被破壞，白蛋白大量滲出；，與模型組相比，DHI、DPA組大鼠脊髓組織EB熒光強度明顯減弱(P＜0.05)，說明DHI、DPA組中BSCB結構的損傷有所恢復；DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

注:A:sham組；B:模型組；C:DHI組；D:DPA組。與sham組相比，*P＜0.05；與模型組相比，＃P＜0.05。下圖同。圖1 各組大鼠神經運動功能評分(n＝10)Note.A，sham group.B，model group.C，DHI group.D，DPA group.Compared with sham group，*P＜0.05.Compared with model group，＃P＜0.05.Same as below.Figure 1 Comparison of neuromotor function scores

圖2 各組大鼠脊髓組織含水量的比較(n＝10)Figure 2 Comparison of spinal cord water content in each group of rats

統計分析各組大鼠脊髓組織EB染色后白蛋白的滲出面積結果如圖3所示，sham組大鼠脊髓組織白蛋白的滲出的分布面積區域零；與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織白蛋白的滲出的分布面積明顯增大(P＜0.05)；與模型組相比，DHI、DPA組大鼠脊髓組織白蛋白的滲出的分布面積明顯減小(P＜0.05)；DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

2.3 電鏡觀察各組大鼠脊髓組織超微結構改變

電鏡下觀察大鼠脊髓組織的超微結構結果如圖4所示，sham組大鼠脊髓組織結構完整，髓鞘清晰可辨，髓神經纖維排列緊密且有規則，髓鞘與軸突結構均可分辨，內外軸膜以及軸索結構正常，細胞內線粒體分布均勻，結構完整，線粒體嵴結構清晰可辨，未見凹陷或者缺失，核染色質分布均勻，核質界限清晰。模型組大鼠脊髓組織髓鞘結構改變明顯，髓鞘間出現巨大間隙，原有的多層致密結構已經消失，或突出形成小囊泡，或斷裂，脫髓鞘嚴重，細胞內線粒體腫脹明顯，嵴結構排列紊亂，腫脹、凹陷、缺失明顯，核染色質固縮，核膜擴張明顯，核質界限不明。DHI組、DPA組大鼠脊髓組織髓神經纖維分布趨于正常，髓鞘結構趨于完整，只有少部分髓鞘板層松散，細胞內多數線粒體結構正常，嵴結構趨于正常。核染色質分布較為均勻，細胞核稍見腫脹，但比模型組以明顯好轉。

2.4 TUNEL染色檢測各組大鼠脊髓組織中的細胞凋亡

TUNEL染色結果如圖5所示，與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織內TUNEL陽性明顯增多(P＜0.05)，與模型組相比，DHI組、DPA組大鼠脊髓組織內TUNEL陽性明顯減少(P＜0.05)DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

統計分析各組大鼠脊髓組織的細胞凋亡率結果如5所示，與sham組相比，模型組的細胞凋亡率明顯升高(P＜0.05)，與模型組相比，經過藥物干預后，DHI組、DPA組大鼠的細胞凋亡率明顯降低(P＜0.05)。DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

2.5 各組大鼠脊髓組織中的氧化應激檢測

本研究中采用DCFH-DA染色來檢測大鼠脊髓組織中ROS的水平，DCFH-DA染色結果如圖6所示，sham組大鼠脊髓組織中基本不見綠色熒光，與sham組相比，模型組中的DCFH-DA陽性細胞明顯增多(P＜0.05)，與模型組相比，DHI組、DPA組大鼠的DCFH-DA陽性細胞明顯減少(P＜0.05)，DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

圖3 EB染色結果(n＝10)Figure 3 The result of EB staining

注:A:sham組；B:模型組；C:DHI組；D:DPA組。圖4 電鏡觀察各組大鼠脊髓組織的超微結構改變(n＝10)Note.A，sham group.B，model group.C，DHI group.D，DPA group.Figure 4 Ultrastructural changes of spinal cord tissues of rats in each group observed by electron microscopy

統計分析綠色熒光強度結果如圖6所示，與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織中細胞的綠色熒光強度明顯增強(P＜0.05)，說明模型組大鼠脊髓組織內ROS水平明顯升高；與模型組組相比，DHI組、DPA組大鼠脊髓組織內細胞的綠色熒光強度明顯減弱，說明大鼠脊髓組織內ROS水平明顯降低；DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

用試劑盒檢測氧化應激反應中相關底物和酶活性，結果如圖7所示，與與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織的MDA的含量明顯增加，而SOD酶活性明顯降低，差異具有統計學意義(P＜0.05)；與模型組相比，DHI組、DPA組大鼠脊髓組織內MDA的含量明顯降低，而SOD酶活性明顯增強，差異具有統計學意義(P＜0.05)，DHI組和DPA組相比，差異無統計意義(P＞0.05)。

2.6 Western blot檢測各組大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK的表達

為了進一步探討右美托咪定對大鼠脊髓缺血再灌注損傷的作用機制，本研究采用Wetern blot法檢測大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK蛋白的表達，結果如圖8所示，與sham組相比，模型組大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)；和模型組相比，DHI組、DPA組大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK蛋白表達水平明顯升高(P＜0.05)。DHI組和DPA組相比，蛋白表達差異不明顯(P＞0.05)，不具有統計學意義。

圖5 TUNEL染色結果(n＝10)Figure 5 The result of TUNEL staining

圖6 DCFH-DA染色結果(n＝10)Figure 6 The result of DCFH-DA staining

圖7 各組大鼠脊髓組織氧化應激反應中底物和酶的變化(n＝10)Figure 7 Changes of substrates and enzymes in the oxidative stress response of spinal cord tissue in each group of rats

圖8 Wetern blot法檢測各組大鼠脊髓組織中CXCR4、p-FAK蛋白的表達(n＝10)Figure 8 Wetern blot detection the expression of CXCR4 and p-FAK protein in spinal cord tissue of rats in each group

3 討論

SCIRI作為原發性脊髓損傷后的繼發性損傷是造成患者神經運動功能受損的重要因素。研究表明[11]SCIRI的病理過程主要是在導致脊髓缺血的因素去除后，脊髓重新供血，但神經功能卻沒有相對應恢復，反而是在缺血損傷的基礎上進一步加重，進而導致脊髓神經元出現遲發性的細胞凋亡，難以維系血-脊髓屏障的完整性，造成患者的運動障礙。由此尋找一種能有效預防或者減輕由SCIRI后的神經細胞凋亡率的藥物或者治療手段是改善脊柱損傷患者治療及預后的的關鍵所在。

針對SCIRI的藥物研發一直是醫藥界的研究重點。右美托咪定是臨床上用于鎮靜、鎮痛的一線藥物。大量的的研究證實[12]右美托咪定具有抗焦慮、穩定血流動力學、抑制交感神經興奮、減少麻醉用藥量、利尿以及抗寒顫的作用。臨床研究表明[13]右美托咪定在缺血再灌注損傷中具有明顯的器官保護作用。張世平等[14]研究表明右美托咪定可有效降低糖尿病大鼠心肌缺血再灌注時的心肌細胞的凋亡，降低炎性因子水平，具有明顯的心臟保護作用。龔輝等[15]研究證實右美托咪定可減輕大鼠腦缺血再灌注急性期的損傷，抑制神經元變性和凋亡，促進大鼠長期的神經功能恢復。姜遠旭等[16]研究表明右美托咪定則能夠明顯抑制NF-κB的表達，來緩解急性腎損傷后的氧化應激。本研究構建SCIRI大鼠模型后，模型組大鼠神經運動功能評分明顯降低，脊髓組織的含水量明顯增加，BSCB完整性被破壞；經過右美托咪定干預后DHI組大鼠神經運動功能評分明顯升高，脊髓組織的含水量明顯降低，BSCB的完整性有所改善。說明右美托咪定對SCIRI大鼠的具有明顯的治療作用。

趨化因子受體(chemokine receptor 4，CXCR4)是基質細胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factoR-1α，SDF-1α)特異性受體。SDF-1α與CXCR4結合后可通過Gi亞基激活其下游的胞質酪氨酸蛋白激酶FAK，使其發生磷酸化生成p-FAK。研究證實[17]CXCR4-FAK信號通路在骨髓源性細胞的黏附、遷移中的各環節中發揮關鍵作用。Li等[18]研究證實CXCR4-FAK信號通路調控移植骨間充質干細胞向脊髓損傷后的部位遷移，阻滯細胞的異常凋亡，促進脊髓的修復。研究顯示[19]CXCR4-FAK信號通路與胚胎期祖細胞的關系密切，由此CXCR4-FAK信號通路可促進機體內許多信號通路的激活，如PI3K/AKT/mTOR信號通路、RAS/MAPK通路、JNK/p38MAP信號通路等，增強細胞的趨化、運動、生長與增殖能力，以抵抗異常的細胞凋亡。當細胞出現應激損傷時，細胞因子表達增加，進而引起CXCR4的表達增加，原始細胞或者祖細胞的免疫應激開始響應，共同協調作用，激活SOD的酶活性等相關酶活性，促進ROS清除，抑制細胞的氧化應激以及細胞的異常凋亡，促進受損組織的再生、修復。Jiang等[20]研究證實提高CXCR4表達后能明顯抑制細胞內ROS的蓄積，下調細胞內的氧化應激。本研究使用CXCR4激動劑作為對照組，結果發現在提高CXCR4的表達后，大鼠脊髓組織的細胞凋亡率明顯下降，細胞內ROS的含量明顯降低，脊髓組織的氧化應激反應減弱，大鼠SCIRI損傷明顯好轉。觀察指標的變化趨勢與DHI組變化趨勢一致，推斷右美托咪定可能通過激活CXCR4-FAK信號通路發揮對SCIRI大鼠脊柱的保護作用。

綜上所述，右美托咪定對脊髓缺血再灌注大鼠的保護作用，與CXCR4-FAK信號通路有關，其機制通過激活CXCR4-FAK信號通路，降低ROS的蓄積，抑制氧化應激導致的細胞凋亡，從而發揮對SCIRI后脊髓組織的保護作用。但右美托咪定是否通過其他信號通路發揮對脊髓組織的保護作用還待更深入的研究。