國產小麥品種麩皮結構層的定性和定量分析方法

陳中偉 夏 清 黃清清 孫 俊 徐 斌 姜 松

(江蘇大學食品與生物工程學院1，鎮江 212013)

(江蘇大學農產品加工工程研究院2，鎮江 212013)

我國是小麥生產和消費大國，小麥的年產量和年消費量約達1.26億t和1.2億t[1, 2]。然而，國內全麥粉及全麥食品加工業發展緩慢。目前，回填法加工全麥粉由于能耗低、與現有裝備銜接性好，是國內加工全麥粉的主流方法。麥麩是小麥粉加工的主要副產物，富含膳食纖維、酚類、B族維生素和礦物質等，具有促進平衡膳食、益生腸道、調脂降糖等功能[3-5]，是回填法加工全麥粉的主要原料之一。然而，由于缺乏相應的產品標準和量化測定手段，麥麩添加量無法準確測定，市場上的全麥粉質量層次不齊，難以得到消費者認可。

目前，已有關于麥麩結構層的標示成分的研究。法國農科院團隊對歐美小麥的麥麩結構層標示成分的研究結果表明，阿魏酸脫氫三聚體、烷基間苯二酚(ARs)、p-香豆酸、植酸分別富集在外果皮、中間層、糊粉層細胞壁和細胞內容物中，可定量標示外果皮、中間層、糊粉細胞壁、糊粉細胞質的含量[6-8]。然而，小麥的生化組成及含量受品種和種植地域的影響很大[9-11]。因此，國內小麥產品的判定不能套用國外品種的數據，需要建立以國產小麥品種為基礎的測定數據。然而，目前針對國內小麥品種麩皮結構層標示物的研究缺乏，難以為國內全麥粉及全麥食品的真偽判定提供支撐。

本研究選取具有代表性的6種國產小麥品種(2種紅麥和4種白麥)，手工剝離獲取麥麩結構層，然后通過微觀染色、顯微觀察，獲取小麥結構層的微觀結構特征；并利用HPLC、顯色法等方法分別定量測定麥麩結構層中的酚酸、酚脂和磷等生化成分的含量，得出各結構層中相關標示物的組成及含量，并對其準確性進行定量驗證，以期為全麥粉及全麥食品的定性和定量判定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅麥(云麥42、云麥59)、白麥(鄭麥9023、濟麥22、川麥107、煙農21)：購于小麥種站；麥麩；p-香豆酸(色譜純)、3,4,5-三甲氧基肉桂酸(色譜純)、橄欖醇(色譜純)；阿魏酸(98%)、乙酸乙酯(分析純)；甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純)。

1.2 儀器與設備

UV1800紫外分光光度計；SBA-40C葡萄糖分析儀；Aglient1260高效液相色譜儀、色譜柱：Eclipse Plus Phenyl-Hexyl column(5 μm, 250 mm×4.6 mm)、ZORBAX C18 column (5 μm，250 mm×4.6 mm)、 CX-31顯微鏡和CX-51熒光顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 小麥麩皮結構層的手工剝離制備

取小麥籽粒10 g，在4 ℃條件下用水浸泡24 h。利用鑷子從麥芒一端剝離外果皮，同時去除胚芽。然后，將剝離外果皮后的小麥籽粒繼續浸泡至松軟，將小麥籽粒縱向切成兩半，刮盡胚乳，得到中間層和糊粉層。最后，將糊粉層輕輕刮下，剩余的結構層為中間層。將樣品干燥至12%含水量后，稱量獲得麥麩各結構層的質量比例[12]。

1.3.2 麥麩結構層的顯微結構觀測方法

表面顯微結構觀測：將麥麩各結構層樣品置于蓋玻片上，滴加去離子水后加蓋玻片，置于顯微鏡下觀測，選取具有代表性的圖片。截面顯微結構觀測：切片的制備、染色過程及觀測方法參考文獻[13, 14]。截面結構切片的制備：取15 mL去離子水于25 mL燒杯中，加入1 g瓊脂后置于沸水浴中溶解。添加0.5 g麥麩結構層粉末，攪拌均勻，利用超聲脫氣(脫氣期間溫度不低于45 ℃)。脫氣后迅速將燒杯置于-18 ℃，待瓊脂凝固后切成1 cm小塊。將瓊脂塊置于1%戊二醛溶液中12 h，然后利用冷凍切片機切出厚度為8 μm薄片，置于載玻片上，晾干后，分別用1%酸性品紅-乙醇溶液和0.01%熒光增白劑-水溶液染色2 min，洗去多余染色液，晾干封片。利用熒光顯微鏡(400～410 nm)進行觀測，選取代表性的樣品圖片。

1.3.3 酚酸含量測定

稱取麥麩各結構層(過150目篩)20 mg，加入10 mL的2.0 mol/L的NaOH溶液，充氮后置于恒溫搖床中，在35 ℃，120 r/min的黑暗條件下水解2 h。然后，加入50 μL的1 mg/mL的3,4,5-三甲氧基肉桂酸的50%甲醇水溶液作為內標物，并用6 moL/L鹽酸中和至pH=2。用20 mL乙酸乙酯分萃取兩次，合并萃取液并濃縮至2 mL。利用氮氣吹干后，加入0.8 mL的50%甲醇復溶。最后，用0.45 μm有機相微濾膜過濾后，用于HPLC測定，并根據文獻方法計算含量[15]。酚酸的高效液相色譜測定方法：檢測器：紫外檢測器；波長：325 nm；進樣量：20 μL；流動相：A：1 mmol/L三氟乙酸水溶液；B：乙腈/1 mmol/L三氟乙酸水溶液(90∶10，V/V)；流速：1 mL/min；柱溫：45 ℃；流動相梯度：0～15 min：85% A；15～20 min：82% A；20～25 min：80% A；25～55 min：72% A；55～58 min：55% A；58～60 min：85% A。

1.3.4 烷基間苯二酚含量測定

稱量0.2 g待測樣品，加入50 μL的1 mg/mL橄欖醇-甲醇溶液作為內標物，加入20 mL乙酸乙酯，在25 ℃避光條件下振蕩提取24 h。然后，在4 000×g條件下離心15 min，取4 mL上清液用氮氣吹干后復溶于1 mL甲醇中。最后，用0.45 μm有機相微濾膜過濾，密封后供HPLC分析，液相測定條件：Angilent 1260；ZORBAX C18 column色譜柱 (5 μm，250 mm×4.6 mm)；熒光檢測器，激發波長276 nm；發射波長306 nm；流速：1 mL/min；柱溫：59 ℃；流動相A：甲醇/水(89∶11，V/V)；流動相B：甲醇/水(99∶1，V/V)；流動相梯度：0 min，A∶B (100∶0)；6 min，A∶B (75∶25)；18 min，A∶B (0∶100)；20 min，A∶B (100∶0)；22 min，A∶B (100∶0)[16]。

1.3.5 總磷含量測定

參照GB/T 6437—2002測定總磷含量。

1.3.6 數據統計

2 結果與討論

2.1 國產小麥品種麩皮結構層的比例及顯微結構

2.1.1 國產小麥品種中麩皮結構層的比例

圖1為手工剝離所得小麥麩皮結構層。中間層的色澤最深，呈棕黃色；糊粉層的色澤最淺，呈乳白色。由于糊粉層是胚乳最外層，其色澤接近于胚乳細胞；外果皮呈淺黃色，具有半透明性。

圖1 手工剝離所獲小麥麩皮結構層(云麥59)

表1列出了6種國產小麥的麥麩結構層相對比例。麩皮所占麥粒的比例約為18%，其中白麥總體略高于紅麥；麥麩中外果皮所占比例最小，其次為中間層，糊粉層所占比例最大，約占50%。紅麥外果皮比例略高于白麥，而糊粉層在白麥中所占比例略高于紅麥。6種小麥中，糊粉層和中間層所占比例的品種間極差較小(<10%)，外果皮的極差較大(20%)，同時國內小麥品種與國外品種也有一定差異[17]。

表1 6種中國小麥中麥麩及其結構層的相對比例

注：同列中相同字母代表在P<0.05水平無顯著差異，不同字母代表有顯著性差異。

2.1.2 小麥麩皮結構層的表面顯微結構

圖2為小麥麩皮結構層的顯微結構，分別選取了具有代表性的白麥(濟麥22)和紅麥(云麥59)。如圖2所示，外果皮由狹長的纖維狀細胞交替構成，細胞大小約為80 μm×40 μm(圖2a1)。中間層由內果皮、種皮和透明層組成(圖2b1)。紅麥的中間層(圖2b2)色澤較深，種皮中呈現棕色斑點，白麥的中間層中未呈現色素斑點。糊粉層(圖2c1和圖2c2)由大小約為50 μm的不規則的細胞組成，與外果皮的纖維狀細胞不同，糊粉層細胞厚大，透光率低。小麥麩皮結構層的顯微結構具有明顯不同，可以通過顯微觀測輕易分辨。

注：a1、b1和c1為白麥(濟麥22)的外果皮、中間層(Tc：種皮；Nu：珠心層；Cc：橫狀細胞)及糊粉層；a2、b2和c2為紅麥(云麥59)的外果皮、中間層及糊粉層；圖中標尺為200 μm。圖2 小麥麩皮結構層的表面顯微結構

2.1.3 小麥麩皮結構層的截面顯微結構

圖3為剝離前后小麥麩皮的橫截面顯微結構。經酸性品紅和熒光增白劑染色后，麥麩糊粉層為粉紅色(圖3a)，主要是由于麥麩糊粉層中的蛋白質與酸性品紅結合造成。圖3b為熒光下麥麩結構層的微觀結構。在紫外光激發下，糊粉層的細胞壁呈亮藍色，其內容物則呈暗紅色；而外果皮和中間層由于自發熒光呈黃綠色。圖3c～圖3e為剝離后麥麩結構層的熒光顯微結構。圖3c和3d為外果皮和中間層的截面顯微結構，均呈現黃綠色，分別為長、短兩類纖維細胞結構。由圖3e可知，糊粉層為單層厚細胞，經熒光增白劑染色后，細胞壁呈亮藍色，細胞內容物呈暗紅色。

經酸性品種和熒光增白劑染色后，外果皮和中間層因自發熒光呈現黃綠色，糊粉層細胞壁和內容物則呈亮藍色和暗紅色。通過觀察熒光激發條件下的麥麩截面顯微結構，可以確定麥麩結構層的剝離和富集情況。

注：a和b分別為光學和熒光顯微鏡下的麩皮結構；c～e為剝離后的外果皮、中間層和糊粉層。圖3 麥麩截面顯微結構

2.2 國產小麥品種麩皮結構層的標示物成分

通過顯微觀測可以確定麥麩結構層的分離和富集情況，但要定量麥麩結構層的添加比例，還需要采用標示物法，即通過分析麥麩結構層中的特有成分或含量差異懸殊的組分含量，然后計算結構層在樣品中添加比例。研究表明，外果皮、中間層和糊粉層分別富含阿魏酸脫氫三聚體、烷基間苯二酚(ARs)和植酸[6-8]。因此，此部分對中國小麥麩皮結構層中此類成分的含量進行分析。

2.2.1 國產小麥品種麩皮結構層中酚酸含量

如表2所示，外果皮、中間層和糊粉層中均含對位香豆酸和阿魏酸。其中，中間層的對位香豆酸含量最低，外果皮的平均含量最高，其次為糊粉層，這與文獻[6-8]結果有較大差異。在6種國產小麥的麩皮結構層中，糊粉層中阿魏酸的含量均最高，中間層次之，約為外果皮中含量的2～3倍。已有結果表明，透明層的阿魏酸含量較高[17]。由于中間層包含透明層，因此，中間層中阿魏酸含量也較高。然而，阿魏酸只能粗略定性糊粉層和外果皮的富集程度，不足以作為麥麩結構層的定量標示物。

表3中為不同麥麩結構層中阿魏酸二、三聚體的含量。由表3可知，外果皮中阿魏酸脫氫二聚體(DFA)的含量最高，分別是糊粉層和中間層中含量的3倍和4倍。6種小麥中，外果皮中DFA的含量隨品種變化的極差較大，而中間層和糊粉層中DFA的含量極差較小。有學者研究表明，阿魏酸脫氫三聚體主要分布在外果皮中[6, 7]，其中5-5’,8-O-4’阿魏酸脫氫三聚體(TriFA)可以作為外果皮的標示物。而在本研究中，外果皮中5-5’,8-O-4’TriFA的含量很低，8-8’,8-O-4’TriFA的含量最高，分別是糊粉層和中間層含量的4.3倍和3.5倍。因此， 8-8’,8-O-4’TriFA可以作為大致定量外果皮的標示物，但由于其在麥麩結構層中差異性相對較小，不足以作為精確定量標示物。

表2 不同小麥品種麩皮結構層中主要酚酸單體的含量

表3 不同小麥品種的麩皮結構層中阿魏酸脫氫聚體含量/mg/g

2.2.2 國產小麥品種麩皮結構層中的烷基間苯二酚含量

麥麩中烷基間苯二酚主要由C17∶0、C19∶1、C19∶0、C21∶1、C21∶0、C23∶0、C23∶1和C25∶0八種同系物組成，其中C19∶0，C21∶0和C23∶0含量較高，見圖4。在麥麩結構層中，中間層所含ARs最高，分別約為外果皮和糊粉層中含量的110倍和230倍，與國外小麥品種相似[18]，且ARs的含量在6種小麥品種間的極差較小，見表4。因此，ARs可作為定量中間層含量的標示物。根據測定結果，中間層占小麥麩皮比重為30%，麥麩占小麥籽粒18%。根據AACC標準，國產全麥粉或全麥食品中(全麥粉>50%)，ARs的含量應大于0.32 mg/g。國內研究調查表明，國產全麥粉中AR含量只有0.12 mg/g[19]，遠小于全麥粉標準。

圖4 小麥麩皮結構層中烷基間苯二酚類化合物的液相色譜圖(以中間層為例)

表4不同小麥品種的麩皮結構層中烷基間苯二酚含量/mg/g

小麥品種外果皮中間層糊粉層濟麥22(白麥)0.086±0.0079.562±1.0800.037±0.002煙農21(白麥)0.152±0.00612.792±1.9110.084±0.005鄭麥9023(白麥)0.068±0.00311.898±1.3530.040±0.003川麥107(白麥)0.151±0.00613.650±0.9280.070±0.006云麥42(紅麥)0.069±0.00411.092±1.5400.031±0.004云麥59(紅麥)0.122±0.00912.439±0.8470.046±0.001平均0.10811.900.051品種間極差0.0844.090.053

2.2.3 國產小麥品種麩皮結構層中的總磷含量

國外學者一般以植酸作為麥麩糊粉層的標示物。研究表明，麥麩中80%以上的磷以植酸形式存在，且富集在糊粉層中[8, 20, 21]；同時，與植酸測定相比，磷含量測定相對簡單，且測定精度較高。因此，采用總磷代替植酸作為麥麩糊粉層的定量標示物。由表5可知，糊粉層中總磷含量最高，約為外果皮和中間層中含量的20倍。總磷可作為定量計算糊粉層的標示物。

表5 小麥麩皮各個結構層中總磷含量/mg/g

2.3 小麥麩皮結構層的定量方法驗證

根據麥麩各結構層標示物成分匯總結果(表6)，建立麥麩結構層的定量方法。

中間層比例= [ARs]樣品/[ARs]中間層×100%

糊粉層比例= [P]樣品/[P]糊粉層×100%

胚乳比例= [淀粉]樣品/[淀粉]胚乳×100%

外皮層比例= 100%-中間層比例-糊粉層比例-胚乳比例

式中：ARs為總烷基間苯二酚含量；P為總磷含量。

表6 小麥麩皮各結構層中標示物含量匯總

根據公式計算白麥(濟麥22)和紅麥(云麥59)的麥麩各結構層的相對比例，與手工剝離的樣品進行對比，驗證結果見圖5。濟麥22的標示物法計算所得糊粉層比例與手工剝離的比例相當，云麥59的標示物法計算得糊粉層比例較手工比例高2.8%，主要是因為所測的總磷中包含外果皮和中間層中的磷含量造成的。總體上糊粉層的比例與真實值的偏差為6%左右，非糊粉層部分與手工剝離結果的偏差小于10%(分別為7.1%和7.2%)。不同品種中小麥成分差異較大，可能也會影響標示物法的準確性。Hemery等[6]、Antoine等[7]和Ross等[22]曾利用標示物法定量研究過歐洲小麥麩皮結構層比例。結果表明，標示物定量的準確性與小麥品種具有較大相關性，但可以較為準確的定量結構層的比例。以所測定的標示物含量平均值作為標準，可以較為準確定量國產小麥品種中麥麩結構層的添加比例。

圖5 麥麩結構層比例(濟麥22和云麥59)的標示物法定量結果與手工剝離結果的對比

3 結論

對6種國產小麥籽粒中的麥麩結構層手工比例、顯微結構觀測和標示物成分分析，結果表明，國產小麥品種中麥麩及其結構層的比例與國外小麥相似，麥麩結構層比例的品種間差異較小。其次，外果皮、中間層和糊粉層的顯微結構具有明顯區別，可以通過光學或熒光顯微鏡定性判定麥麩顆粒的大致添加量、組成和剝離情況。與外國小麥品種相似，國產小麥品種麩皮的ARs主要富集在中間層中，平均含量為11.9 mg/g，小于國外小麥品種中含量；國產小麥中糊粉層中磷的平均含量達28.7 mg/g，約為非糊粉層中磷含量的20倍，可以用于定量標示糊粉層的含量；p-香豆酸、阿魏酸及阿魏酸二、三聚體雖然在外果皮中有一定的富集性，但不足于作為準確定量外果皮的標志物。ARs和總磷可分別作為定量中間層和糊粉層的標示物，而外果皮的含量可間接計算獲得。以本文所獲方法和數據，可以較為準確地定性和定量判定國產全麥產品的真偽和麥麩的相對添加比例。