超聲輔助制備淀粉微晶及其對姜黃素的吸附

謝嵬旭 張華麗 齊若男 蘇玉春 汪樹生

(吉林農業大學，長春 130118)

玉米淀粉是由結晶區和非結晶區共同組成的大分子聚合物，其分子式為(C6H10O5)n。由于其產能過剩，并且原淀粉的結構導致其應用領域受限，所以開發淀粉的新用途在當今社會尤為重要。對原淀粉進行處理，使其具有適合某種特殊用途的性質、增加其利用途徑的這一過程被稱為淀粉變性，其產品稱為變性淀粉，淀粉微晶是變性淀粉的一種。用酸對淀粉進行長時間溫和水解，或者用酶對淀粉顆粒溫和水解50%以上得到的固體與原淀粉相比，結晶度均有所增加，這種剩余產物稱為淀粉微晶[1]。一般而言利用酸或者酶將淀粉顆粒中的非結晶區減少甚至除去，或者將淀粉鏈變短提高結晶度會得到淀粉微晶[2]。早在20世紀， Robin等[3]和Stephen等[4]開始研究水解法制備淀粉微晶，利用強酸破壞淀粉松散的無定型區，剩下的產物為淀粉中難以被酸破壞的結晶區，這種淀粉被稱作Lintners淀粉[5]。

淀粉微晶包括淀粉微晶束、片晶或其他晶形的聚集體[6～9]。其比表面積和孔洞相對于原淀粉來講均有所增加，使其具有良好的吸附性能等。利用不同方法制備的淀粉微晶可以改良淀粉的某一特性供人們更好地利用。淀粉微晶中含有的葡萄糖以及葡萄糖聚合物使其具有一定的甜度，可以用做食物的甜味劑；淀粉微晶做的食物可以用作膳食，由于淀粉微晶能夠很好地模仿脂肪的口感，并且在人體中分解吸收較為緩慢，可以用作脂肪的取代品，作為減肥食品。用它來做藥物的賦形劑擁有良好的崩解能力，使藥物藥效快分散快[10，11]。目前生產淀粉微晶的主流方法是通過回生法、水解法、結晶法、冷凍結晶法等途徑，水解淀粉的非結晶區，或者是將非結晶區轉變為結晶區，使其結晶度增大。但是目前制備淀粉微晶工序煩瑣，前期投入高，不利于工業生產。超聲波是一種機械波，作用機制體現在高溫分解和自由基撞擊以及機械化學作用，在鹽酸溶液中，可以有效破壞淀粉顆粒中的C-C鍵，降低淀粉顆粒的分子質量，促使淀粉水解的正向進行[12]。因此，本研究采用超聲波輔助酸醇水解制備淀粉微晶，為淀粉的工業利用找到一種成本低廉、操作簡單、反應可控的制備途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

玉米淀粉(食品級)；鹽酸(分析純36%～38%)；姜黃素(分析純)；碳酸氫鈉(分析純99.5%)；乙醇(分析純99.7%)；3，5-二硝基水楊酸(分析純)；氫氧化鈉(分析純)；酒石酸鉀鈉(分析純)。

1.2 實驗儀器

101-2AB電熱鼓風干燥箱；SHB-B95 型循環水式多用真空泵；722S分光光度計；X1R高速冷凍離心機；KQ-250B超聲波清洗器；HZQ-F160振蕩培養箱；SSX-550掃描電子顯微鏡。

1.3 方法

1.3.1 淀粉微晶的制備

稱取30.00 g玉米淀粉，分散到100 mL鹽酸和乙醇混合溶液中，25 ℃恒溫水浴超聲處理30 min后迅速置于恒溫搖床中，在設定的轉速和溫度下水解。反應結束后，加入碳酸氫鈉終止反應，4 000 r/min離心5 min，摒除上清液，加入100 mL蒸餾水洗滌至中性后，抽濾，40 ℃烘干12 h，經粉碎、研磨、過100目篩后，得到淀粉微晶。裝入密封袋保存、備用。實驗重復3次。

1.3.2 DNS法測定淀粉水解率

首先進行葡萄糖標準曲線的制作[13]。取1 g 葡萄糖放置80 ℃烘箱中烘干至恒重，取出后精確稱量0.050 0 g葡萄糖溶解于蒸餾水中，定容至50 mL，制得1 mg/mL的葡萄糖標準液，用蒸餾水分別稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8 mg/mL的葡萄糖溶液。取1 mL不同濃度的葡萄糖溶液放入裝有3 mL DNS溶液的試管中，沸水浴反應5 min后，迅速冷卻至室溫。用分光光度計在540 nm波長下的測定吸光度，得到葡萄糖濃度(x)與吸光度(y)關系為y=5.285 8x(R2=0.993 2)。

然后測定淀粉水解率，量取適當稀釋的淀粉水解液1 mL，測量吸光度，利用公式計算淀粉水解率。

式中:C為稀釋后由DNS法測得的吸光度由回歸直線方程求的濃度；N為稀釋倍數；V為上清液的體積；M為淀粉的質量。

1.3.3 姜黃素吸附量的測定

精確稱量干燥的姜黃素標準品0.500 0 g 溶于乙醇溶液中，定容至500 mL，制得1 mg/mL的姜黃素標準液，用乙醇分別稀釋成2、4、6、8、10 mg/L的溶液。用分光光度計在438 nm波長下測量吸光度，繪制標準曲線。姜黃素濃度(x)與吸光度值(y)的對應關系為y=0.109 3x(R2=0.999 8)。隨后稱取淀粉5.00 g，加入25 mL的姜黃素溶液，并置于30 ℃、160r/min恒溫搖床中，避光吸附2 h后，離心，取上清液稀釋，使其吸光度落在姜黃素標準曲線上，在438 nm波長下測量其吸光度。利用公式計算姜黃素吸附量。

式中:C為上清液的吸光度；N為稀釋倍數。

1.3.4 單因素實驗

以姜黃素吸附量為指標，分別考察鹽酸濃度、乙醇濃度、水解溫度、水解時間對吸附量的影響，并確定單因素的最佳值。因素變化范圍為：水解時間(48、60、72、84、96 h)、乙醇體積分數(0%、20%、40%、60%、80%)、鹽酸濃度(1、1.5、2、2.5、3 mol/L)、水解溫度(20、30、40、45、50、55 ℃)。

1.3.5 響應面實驗

以單因素的實驗結果為依據，以姜黃素的吸附量為指標，遴選每個條件的最顯著的3個水平，利用Design-Expert.8.05b軟件中的Box-Behnken Design設計響應面實驗，并且進行數據分析。

1.3.6 電鏡觀察

采用SSX-550型電子顯微鏡進行掃描電鏡分析，觀察淀粉微晶的表面形貌。將樣品用碳膠帶固定于載物臺上，用金粉鍍覆，于真空環境下用5.00 kV的加速電壓觀察并采集圖像。

1.3.7 X射線衍射觀測

采用D8 ADVANCE廣角X射線衍射儀，在條件為Cu靶、1.54埃進行3°～60°的X射線衍射，利用Jade6.0繪制并分析樣品的衍射圖譜。

2 結果分析

2.1 單因素分析

2.1.1 水解時間對淀粉水解率及姜黃素吸附量的影響

如圖1所示，隨著水解時間的增加，淀粉水解率不斷提高，然而淀粉微晶對姜黃素的吸附能力是先增加后降低，在72 h達到最大值。原因是支鏈淀粉構成淀粉顆粒的骨架，直鏈淀粉構成的非結晶區隨機點綴在淀粉顆粒上[2，14]。隨著淀粉水解率增加，直鏈淀粉水解增多，淀粉骨架逐漸裸露，淀粉的比表面積和吸附位點增加[15]。隨著水解率繼續增大，淀粉顆粒漸漸瓦解，使其吸附性能降低。

2.1.2 乙醇濃度對淀粉水解率及姜黃素吸附量的影響

從圖1可以看出隨著乙醇濃度的增加，淀粉水解率不斷降低，淀粉微晶對姜黃素的吸附能力是先增加后降低，這一水解趨勢與盧未琴[2]的研究一致。在乙醇體積分數60%時達到最大值，此時淀粉微晶的吸附性能最佳。在本反應體系中，乙醇的作用不僅是減少與水接觸來限制淀粉微晶的水解，同時也作為絡合穩定劑穩固了即將水解的淀粉鏈，乙醇濃度越大這種穩固效果越明顯。在降低淀粉顆粒水解率的同時，淀粉顆粒完整性逐漸變大，導致淀粉微晶吸附能力的下降[16]。

2.1.3 鹽酸濃度對淀粉水解率及姜黃素吸附量的影響

從圖1中可以看到隨著鹽酸濃度的增加，淀粉水解率先顯著增加后緩慢增加，淀粉微晶對姜黃素的吸附能力是先增加后降低，在鹽酸濃度達到2 mol/L時達到最大值。原因是淀粉顆粒結晶區和非結晶區的淀粉鏈的排列方式不同，結晶區的糖苷鍵不易被接近，很難被水解[5]，所以淀粉顆粒水解分為兩個階段，第一階段主要是非結晶區的水解，此時淀粉比表面積增加，吸附位點變多；第二階段是結晶區參與水解比例增加。淀粉結晶區參與水解比例大大增加，吸附位點逐漸減少，限制了淀粉微晶吸附性能。

圖1 不同水解條件下淀粉微晶吸附量和水解率的變化

2.1.4 水解溫度對淀粉水解率及姜黃素吸附量的影響

如圖1所示，隨著水解溫度的增加，淀粉水解率逐漸增加，淀粉微晶對姜黃素的吸附能力是先增加后降低，在水解溫度達到50 ℃時達到最大值。原因是隨著水解溫度逐步增加，分子活躍性增大，氫離子與淀粉分子接觸頻率增多，反應更加劇烈，導致淀粉水解率逐步增強；在50 ℃后，淀粉結晶區參與水解，淀粉分子孔洞變大，淀粉微晶的吸附位點減少，吸附姜黃素的能力隨之下降。

2.2 響應面分析

2.2.1 響應面條件的確定及結果

選取單因素實驗中對姜黃素吸附較為顯著的3個水平，進行包括水解時間(A)、乙醇濃度(B)、鹽酸濃度(C)及水解溫度(D)在內的四因素三水平響應面實驗，如表1所示。以姜黃素吸附量為考察指標，預測淀粉微晶的最佳反應條件。響應面條件組合及響應值如表2所示。

表1 響應面因素水平

表2 響應面條件組合及響應值

表2(續)

利用Design-Expert.8.05b軟件對結果進行擬合，得到鹽酸濃度(A)、乙醇濃度(B)、水解溫度(C)、水解時間(D)4種因素交互作用制得的淀粉微晶對姜黃素吸附量(R)影響的二次多項回歸方程為：R=2.36+0.22A-0.084B+0.15C-0.043D+0.22AB-0.13AC-0.093AD+0.077BC+0.24BD-0.007 5CD-0.22A2-0.25B2-0.31C2-0.23D2

2.2.2 回歸模型的方差分析

利用Design-Expert.8.05b軟件對結果進行方差分析，回歸方程模型的方差分析見表3。

表3 回歸方程模型的方差分析

注：***為差異性極顯著(P<0.001)；**為差異性高度顯著(P<0.01)；*為差異顯著(P<0.05)。

鹽酸濃度與乙醇濃度交互和鹽酸濃度與水解溫度的交互作用最明顯，淀粉酸水解的原理是反應體系中的H+作用到糖苷鍵上，致使淀粉鏈斷裂，氫離子的濃度增加，與糖苷鍵作用的概率增加，導致水解加速。因此鹽酸的濃度直接決定了反應進行的強度和速率，乙醇與水解溫度的增加或減小，都決定了鹽酸撞擊淀粉分子的強度及頻率，故它們之間交互作用最明顯；乙醇濃度與水解溫度交互作用比較明顯，原因是乙醇可以阻礙鹽酸與水分子的接觸，使其不易糊化，可以適當提高水解溫度進行反應，而水解溫度決定了反應進行的速度，水解溫度太低，反應不夠強烈，導致水解率不高，淀粉分子比表面積小，吸附性不高，水解溫度太高，雖然可以間接增加水解率，但是會使淀粉糊化，使其失去吸附性能；鹽酸濃度與水解時間交互、乙醇濃度與水解時間交互、水解溫度與水解時間交互的交互作用不明顯，原因是水解時間雖然梯度增加，但是相對于總體水解時間基數來說，梯度不是很大，因此時間并不是主要因素。

2.2.3 響應面優化與驗證

由回歸方程得到的優化實驗最優水解條件是：鹽酸濃度2.24 mol/L、乙醇體積分數59.58%、水解溫度50.70 ℃、水解時間為69.63 h，預測得到的淀粉微晶吸附姜黃素的量為2.425 mg/g。驗證實驗為方便操作，將條件簡化為：鹽酸濃度 2.2 mol/L、乙醇體積分數60%、水解溫度 51 ℃、水解時間 69.5 h。此條件制備得到的淀粉微晶吸附姜黃素的量為2.422 mg/g，實測值與方程預測值較為吻合，能充分表明模型的正確性，可以用來優化超聲輔助制備淀粉微晶的工藝。

2.3 淀粉形態觀察

淀粉微晶在SEM下觀測的形態如圖2所示。通過電鏡觀察，發現原淀粉表面光滑沒有孔洞，完整的表面結構使姜黃素進入淀粉內部困難，只能附著于淀粉分子表面，所以吸附性不好；隨著水解時間延長，淀粉輕度水解，淀粉分子表面變得粗糙，淀粉分子開始出現孔洞，增加吸附位點和比表面積，從而增加了吸附姜黃素的能力；隨著淀粉繼續水解得更加徹底，淀粉分子呈現碎片化的狀態，比表面積相對于原淀粉增加了；但是隨著淀粉的碎片數量增加，其表面孔洞消失不見，淀粉比表面積反而降低，所以隨著水解時間延長，淀粉吸附能力反而下降。

圖2 淀粉微晶的形貌

2.4 X射線衍射圖譜分析

不同水解時間的淀粉微晶及原淀粉的X-ray衍射圖譜如圖3所示，隨著水解時間的增加，淀粉微晶和原淀粉的衍射角2θ均在15°、17°、18°和23°左右，峰值所在衍射角并沒有隨著水解時間的增加而發生偏移，這也說明超聲波輔助酸醇水解制備得到的淀粉微晶的晶型并沒有發生改變，且晶型與原淀粉一樣均為A型[17]。隨著水解時間的增加，結晶峰高度開始呈增長趨勢，淀粉微晶的結晶度也隨之增加，在水解72 h之后，淀粉中的結晶區的水解比例增加，結晶區吸水膨脹糖苷鍵斷裂，淀粉鏈進行重排，從而導致淀粉微晶的結晶峰高度下降，結晶率降低。

以姜黃素吸附率為指標測定淀粉微晶的吸附性質，通過表4發現，水解時間為72 h為分界點，在72 h之前，隨著水解時間增加淀粉結晶度和姜黃素吸附量不斷增加。這是因為淀粉直鏈隨著水解時間增加不斷溶解，堅實的結晶區暴露，導致淀粉比表面積和吸附位點增加，粗糙的微晶顆粒表面非結晶區水解留下的孔洞可以良好的吸附姜黃素；在水解72 h之后，隨著時間增加，吸附性能也隨之降到原淀粉之下。這是由于淀粉顆粒長時間水解，顆粒中的淀粉鏈重排，淀粉鏈之間互相黏連，形成一種膠裝的顆粒，無法良好地儲藏姜黃素。

注：a 吸附姜黃素的量最大的淀粉微晶；b 水解96 h；c 水解84 h；d 水解72 h；e 水解60 h；f 水解48 h；g 原淀粉。表4同。圖3 X射線衍射圖

表4吸附量與結晶度

3 結論

超聲波輔助酸醇水解制備得到的淀粉微晶晶型不改變，吸附位點和比表面積增加，對吸附姜黃素的能力有明顯提高作用。通過響應面實驗設計并優化制備得到的淀粉微晶吸附姜黃素的量為2.422 mg/g，比原淀粉吸附量0.709 mg/g提高241.61%。本實驗影響因素少，反應條件簡易可控，適合工業化生產，對淀粉的市場化應用具有一定的指導意義。