采用響應曲面法對Capto adhere填料進行工藝優化

吳光昊 何慧丹 徐翀颿 顧鑫 劉彥君

摘 要 為對復合陰離子Capto adhere 填料進行純化工藝優化，在前期單因素試驗基礎上，CHO細胞表達的IgG1型單克隆抗體細胞培養上清液經親和層析純化后，采用中心復合表面設計（CCF）法優化Capto adhere 填料純化工藝。以收率、純度、HCP清除率為響應變量，考察pH、電導率、載量3個關鍵因素對純化工藝的影響，擬合模型并驗證。優化后最佳工藝條件為：pH 7.0，電導率 16.4 ms/cm，載量300 mg/ml，在此條件下，收率、純度和HCP清除率分別可達（90.77±0.77）%、 （99.55±0.05）%和（88.93±2.14）%。與預測結果偏差均<5%，模型得到驗證。試驗結果表明本研究Capto adhere 填料工藝優化是有效可行的。

關鍵詞 中心復合設計 Capto adhere 抗體純化

中圖分類號：TQ464.7 文獻標志碼：A 文章編號：1006-1533（2020）09-0067-05

Optimization of Capto adhere purification conditions using response surface design

WU Guanghao1*， HE Huidan1， XU Chongfan1， GU Xin1， LIU Yanjun2

（1. Shanghai Jiaolian Drug Research and Development Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China； 2. Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd.， Shanghai 201210， China）

ABSTRACT In order to optimize the purification process of multimodal anion exchange chromatography media Capto adhere， the purification process by Capto adhere was optimized by central composite surface design method after the cell culture supernatant for the expression of monoclonal antibody IgG1 in CHO cells was purified by affinity chromatography. The effects of three key factors such as pH value， conductivity and load on the purification process were investigated using the yield， purity and HCP removal rate as responses， and then the fitting model was validated. The conditions for optimum process were pH 7.0， conductivity 16.4 ms/cm and load 300 mg/ml. The results showed that the yield， purity and HCP removal rate were（90.77±0.77）%， （99.55±0.05）% and （88.93±2.14）%， respectively. The deviations from the predicted results were all less than 5% and the model was validated. The experimental results show that the optimization of purification process by Capto adhere is effective and feasible.

KEy WORDS center composite design； Capto adhere； antibody purification

近年來，治療性單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）藥物在許多疾病治療（如癌癥）方面扮演著重要的角色，該治療方法需要在長時間內供給高劑量的抗體[1]。面對高需求量的單克隆抗體藥物市場，生物公司需要開發新的上下游抗體工藝以減小生產成本。對于上游單抗生產來說，現在的抗體滴度已能達到5～10 g/L；對于下游的抗體純化來說，一般的三步純化步驟可占總生產成本的50%～80%[2]：首先通過親和層析捕獲目的蛋白同時去除大量的宿主細胞蛋白殘留（host cell protein， HCP），DNA以及病毒；然后通過兩步純化（中度純化、精細純化，通常為離子交換層析和疏水層析的組合）進一步去除HCP、聚體以及蛋白A（protein A，PA）[3-4]。為提高純化效率和抗體收率，減少生產成本，復合層析填料應運而生。

Capto adhere是一種應用于生物過程技術的復合陰離子填料，配基為N-芐基-N-甲基乙醇胺，該配基同時具有：①離子相互作用；②氫鍵作用；③疏水作用。在流穿模式下，Capto adhere可吸附HCP，PA，病毒，內毒素等，而抗體流穿，一步去除關鍵雜質，可與親和層析結合組成兩步純化工藝進而達到提高收率的目的[5]。

試驗設計（design of experiments，DOE）是一種基

于數理統計原理研究多個因子與響應變量關系的一種科學有效的方法，其中響應曲面法在生物過程優化應用中最為廣泛[6]。為實現流穿模式下Capto adhere填料性能的最優化，本試驗在前期單因素試驗基礎上，采用試驗設計的方法，對三種關鍵工藝參數pH，電導率，載量進行優化，作為放大生產的依據。

1 材料和方法

1.1 材料

AKTA avant、填料Mabselect及填料Capto adhere（柱體積CV=1.7 ml）購自美國GE公司；層析柱購自美國Millipore公司；無水枸櫞酸、二水合枸櫞酸鈉（湖南爾康制藥股份有限公司）；Tris（Applichem Gmbh-An ITW公司）。

培養液是經上游CHO細胞培養表達的IgG1單克隆抗體（自主研制生產），經過Mabselect親和層析純化后得到800 ml樣品，濃度為13.7 mg/ml，純度為98.2%，HCP殘留的體積分數為0.297 1%。

1.2 方法

1.2.1 中心復合表面設計

在前期的單因素試驗中，確定pH、電導率、載量的范圍分別為：5～7，3～20 ms/cm，100～300 mg/ml。根據CCF試驗設計原理采用Design-Expert V8.0.6.1（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN）進行響應曲面設計（表1）。

選擇中心點重復試驗3次，系統生成17個試驗，包括8個角點，6個軸點，1個中心點（重復試驗3次），未設計分組。本次試驗按照系統所生成的隨機順序進行（表2）。

1.2.2 樣品處理

配制20 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH和電導率如表2，然后分別用1 mol/L Tris溶液和20 mmol/L枸櫞酸+1 mol/L NaCl溶液調節pH和電導率使與緩沖液一致，樣品來源于Mabselect親和層析純化得到的產物。

1.2.3 色譜條件

將Capto adhere層析柱用20 mmol/L枸櫞酸緩沖液充分平衡后，以0.4 ml/min的上樣速度上樣，達到相應條件下的載量。再用平衡緩沖液充分平衡并收集流穿液。

2 結果

將表2數據輸入軟件Design-Expert V8.0.6.1，獲得試驗分析結果。試驗數據分析分為以下幾個部分：模型擬合；模型診斷及ANOVA分析；模型分析及驗證。設定響應值上下限分別為收率90%～100%，純度99%～100%，HCP清除率0～100%，利用軟件分析生成響應曲面，在給定因子水平范圍內得出最佳點及操作范圍并對最終模型進行驗證。

分別對響應變量收率，純度，HCP清除率及3因子pH，電導率，載量進行二階模型擬合，各響應變量擬合方程分別為：

Y1，Y2，Y3分別代表響應變量收率，純度及HCP清除率；A，B，C分別代表因子pH，電導率和載量。結果表明，二階方程（1）、（2）、（3）線性擬合程度良好，對應R2分別為0.73，0.81，0.92，表示模型分別能夠解釋73%，80%，92%的均值方差；變異系數CV值分別為4.14%，0.18%，4.12%，，該試驗結果表明試驗值與預測值偏差較小，具有較高的精度，并且試驗具有高度可靠性；信噪比分別為8.353，9.558，11.041，一般來說，信噪比大于4說明具有較高的信號值[7]，3個模型信噪比均大于4，說明試驗信號良好。總體來說，3個響應變量與獨立因子pH，電導率，載量的回歸模型均具有較高的線性擬合度及可靠性。

2.1 模型診斷及ANOVA分析

觀察殘差正態性檢驗圖及殘差相對于觀測值順序為橫軸的散點圖，殘差符合正態分布，無明顯奇異點（圖未給出）；Box-Cox圖顯示l均等于1（圖未給出），表明數據符合正態性分布，無須做冪次變換。

收率響應曲面擬合方程方差分析結果如表3所示。

純度響應曲面擬合方程方差分析結果如表4所示。

純度響應曲面擬合方程方差分析結果如表5所示。

以上ANOVA分析結果顯示回歸模型均具有顯著性（P值均小于0.05），其中響應變量純度及HCP清除率擬合模型具有極顯著性（P值均小于0.01）。對模型進行失擬檢驗，失擬項（lack of fit）F值為失擬平方和與純誤差平方和的比值，在三個模型中，失擬項F值均較低，P值分別為0.099 9，0.079 0，0.388 6，均大于0.05，表明模型擬合良好，模型可信。

2.2 模型分析驗證

根據試驗模型擬合出響應曲面圖及等高線圖可以直觀地看出響應變量與各水平因子之間的關系及各因子之間的相互作用（圖1）。等高線越密集說明響應變量對因子的變化越為敏感，載量設定為300 mg/ml時，固定電導率，隨著pH的增加，收率和純度也將增加，并且增幅較大，而HCP清除率隨之減少；固定pH，隨著電導率的增加，純度和HCP清除率相應減小，而收率變化呈“U”型，這些結果均說明需將各因子調整至合適水平以達到給定水平范圍內最佳效果。

根據軟件給出的最佳點，將pH調至7.00，電導率調至16.4 ms/ml，載量300 mg/ml，對該最佳點進行工藝驗證，在該條件下重復試驗兩次，所得結果為收率（90.77±0.77）%，與預測值（94.67%）相差4.12%，純度（99.55±0.05）%，與預測值（99.27%）相差0.29%，HCP清除率（88.93±2.14）%，與預測值（87.07%）相差2.00%。結果偏差均<5%。說明所擬合響應曲面模型具有較好的可信度和預測精度。

將響應值上下限分別設定為收率90%～100%，純度 99%～100%，HCP清除率0～100%，利用軟件分析得出操作區間如圖2所示，隨著載量的增加，操作區域也繼續增加，考慮到pH，電導率及載量的調控難易程度，將載量操作范圍確定為250～300 mg/ml，pH操作范圍設定為6.8～7.0，從而可確定電導率操作范圍為11.8～18.0 ms/cm（圖2A）。

3 討論

為提高收率及純度，有必要對下游的抗體純化工藝進行優化，而親和層析往往是第一步。由于Protein A親和層析具有的高性能，其對單抗具有高度的選擇性，并且單抗在經過Protein A親和層析步后，能夠達到很高的純度，因此很難找到能夠替代該填料的選擇以取代該步驟[8]。而在純化的后續步驟中，若能將多步純化步驟整合為一步，將大大提高生產效率。使用復合填料可整合離子交換及疏水層析，是純化工藝的一大趨勢。為確定復合填料Capto adhere范圍內的最佳工藝條件，在本次實驗中，我們采用響應曲面的方法進行DOE設計，對復合填料Capto adhere工藝條件進行優化，條件優化后的收率達（90.77±0.77）%，純度達（99.55±0.05）%，相對于傳統三步層析純化，本研究采用親和層析、Capto adhere兩步純化步驟，有效地提高了收率及純度，降低了成本。

一般來說，對于3因子3水平的DOE實驗，采用中心復合序貫設計的方法設計實驗點是較為常見的方法，設計點包括8個角點，6個星點及一個中心點，星點為給定范圍之外的點。該種方法特點是具有序貫性和旋轉性[9]，響應變量的預測精度在以設計中心為球心的球面上是相同的。本研究采用中心復合表面設計而非中心復合序貫設計，使得設計點均在給定范圍之內，原因是本次試驗中電導率設計范圍為3～20 ms/cm，若采用中心復合序貫設計，取給定范圍之外的星點，則設計點將存在負值，對于電導率來說，不存在負值。此外，由于抗體經親和層析所得樣品電導率為1 ms/cm左右，電導率調至過高將消耗大量鹽，考慮工藝放大時的生產成本，將實驗點設計在給定范圍之內，故而采用中心復合表面設計，這也是響應曲面未出現峰值的原因。

本研究中，收率擬合模型R2=0.73，這可能是由于試驗過程中采用手動收樣，存在收樣誤差而導致數據擬合略有偏差，從而導致R2值相較于純度及HCP清除率響應模型擬合R2值略低。ANOVA分析結果顯示電導率及載量對收率有顯著影響，pH影響不顯著，且收率均較高，這可能是由于pH 5～7的范圍均小于蛋白等電點（pI=8.7），較低的pH下，蛋白帶正電，靜電相互作用力將變弱，進而導致較高的收率[10]。載量對于純度及HCP清除率均無顯著影響，原因可能是載量試驗范圍較小（100～300 mg/ml），導致影響不顯著。

復合填料的出現使得純化步驟精簡、成本降低、收益提高成為可能；DOE使得工藝開發及優化試驗次數大大減少；為實現該填料的性能最大化，其工藝開發和優化還有待進一步深入研究。

參考文獻

[1] Pezzini J， Joucla G， Gantier R， et al. Antibody capture by mixed-mode chromatography： a comprehensive study from determination of optimal purification conditions to identification of contaminating host cell proteins[J]. J Chromatogr A， 2011， 1218（45）： 8197-8208.

[2] 陳泉， 卓燕玲， 許愛娜，等. 蛋白A親和層析法純化單克隆抗體工藝的優化[J]. 生物工程學報， 2016， 32（6）： 807-818.

[3] OConnor E， Aspelund M， Bartnik F， et al. Monoclonal antibody fragment removal mediated by mixed mode resins[J]. J Chromatogr A， 2017， 1499： 65-77.

[4] Toueille M， Uzel A， Depoisier JF， et al. Designing new monoclonal antibody purification processes using mixedmode chromatography sorbents[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci， 2011， 879（13/14）： 836-843.

[5] GE Healthcare. Multimodal Chromatography Media[M]// Handbook 29-0548-08： Multimodal Chromatography Handbook. Uppsala： General Electric Company， 2013： 23-40.

[6] Grieco SH， Wong AY， Dunbar WS， et al. Optimization of fermentation parameters in phage production using response surface methodology[J]. J Ind Microbiol Biotechnol， 2012， 39（10）： 1515-1522.

[7] Long J， Zhao X， Liang F， et al. Optimization of fermentation conditions for an Escherichia coli strain engineered using the response surface method to produce a novel therapeutic DNA vaccine for rheumatoid arthritis[J/OL]. J Biol Eng， 2018， 12： 22. doi： 10.1186/s13036-018-0110-y.

[8] Pinto IF， Aires-Barros MR， Azevedo AM. Multimodal chromatography： debottlenecking the downstream processing of monoclonal antibodies[J]. Pharm Bioprocess， 2015， 3（3）： 263-279.

[9] Dejaegher B， Heyden YV. Experimental designs and their recent advances in set-up， data interpretation， and analytical applications[J]. J Pharm Biomed Anal， 2011， 56（2）： 141-158.

[10] Brekkan E. Multimodal Chromatography[M]//Jagschies G， Lindskog E， ？？cki K， et al. Biopharmaceutical Processing： Development， Design， and Implementation of Manufacturing Processes. Cambridge： Elsevier， 2018： 409-419.