西番蓮PeERG基因克隆及其表達模式分析

樊航 冉娜 李安定 張洪亮 胥猛

摘 要： ERA（Eecherichia coli Ras-like protein）蛋白是與已知異三聚體G蛋白和小分子G蛋白不同的一種新的GTP結合蛋白。為了在木本植物中開展其同源基因ERG（ERA-like GTPase）克隆和功能驗證的相關研究，該文首次在西番蓮新品種‘平塘1號中采用cDNA末端快速克?。≧ACE）技術克隆鑒定1個ERG基因。結果表明：西番蓮PeERG基因cDNA全長為1 518 bp，包括1 260 bp的開放閱讀框、38 bp的5′-端非翻譯區和220 bp的3′-端非翻譯區，該基因編碼蛋白由420個氨基酸殘基組成，其二級結構含有豐富的α-螺旋和延伸鏈。PeERG蛋白不含跨膜區域，也不存在信號肽酶切位點，既在其N端有典型的GTPase保守結構域（GTPase domain）又在其C端有獨特的RNA結合結構域（KH domain）。系統進化樹分析表明，西番蓮PeERG蛋白和水稻OsERG1、擬南芥AtERG1、大腸桿菌ERA位于同一進化分枝。實時定量PCR檢測揭示PeERG基因在西番蓮根、莖、葉、花、果中均有表達，葉中表達最高;同時該基因響應低溫脅迫信號，其表達呈動態變化模式。該研究首次鑒定和描述了木本植物西番蓮的ERG基因，為深入挖掘西番蓮特異基因資源提供參考，也有助于進一步探究ERG基因在植物中的生物學功能及其作用機制。

關鍵詞： ERA蛋白， 西番蓮， RACE， 表達模式， G蛋白， 低溫脅迫

中圖分類號： Q943 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0509-09

Abstract： Different from the known trimetical G protein and small GTPase， ERA （Eocherichia coli Ras-like protein） is a new GTP-binding protein. In order to study cloning and functional verification of ERG （ERA-like GTPase） homologous gene in woody plants， one ERG gene was firstly isolated from a cold-tolerant variety of Passiflora edulis （‘Pingtang 1） through the rapid amplification of cDNA ends （RACE）. The resutls were as follows： The full-length sequence of PeERG cDNA was 1 518 nucleotides， including a 1 260 bp open reading frame （ORF）， flanked by a 38 bp 5′-untranslated region （UTR） and a 220 bp 3′-UTR. PeERG may encode a protein of 420 amino acids， and its secondary structure was rich in alpha helix and extended strand. PeERG protein did not contain both transmembrane region and signal peptidase cleavage site， and had two conserved domains： a GTPase domain and a KH domain. Phylogenetic tree revealed that PeERG was clustered into the same clade as OsERG1， AtERG1 and ERA. （4） Using real-time RT-PCR， the transcripts of PeERG were detectable in various tissues （roots， stems， leaves， flowers and fruits）， and its dynamic expression pattern under low temperature stress was analyzed. Altogether， one ERG gene was isolated from woody plants for the first time. These results will be valuable for further study of the biological function of ERG in plants and enrich the excellent genetic resources of Passiflora edulis.

Key words： Eecherichia coli Ras-like protein， Passiflora edulis， RACE， expression pattern， G protein， low temperature stress

西番蓮（Passiflora edulia）屬于西番蓮科西番蓮屬草質或半木質常綠藤本植物，花朵鮮艷優美，果汁風味獨特、芳香怡人，俗稱百香果、激情果、番石榴、巴西果等，原產南美洲巴西至阿根廷一帶。目前作為國內水果市場的“新寵”，西番蓮在臺灣、福建、廣東、廣西、海南和云南等地栽培推廣（周玉娟等，2008），其商業化品種主要有紫果、黃果、黃果與紫果雜交品種等3大類，其中紫果品種在我國栽培面積最大（鄭文武等，2008）。西番蓮具有較高的營養價值和藥用效果，其果實含有多種人體必需的氨基酸、蛋白質、還原糖、維生素等（黃葦等，2003）;其果汁占鮮果重量的35%～38%，果皮占50%～55%，種子占5%～8%;干果皮中含果膠20%，粗纖維25%（張佳艷和任仙娥，2016）。西番蓮果汁具有芒果、石榴、檸檬等多種水果的濃郁香味，風味獨特，具有“果汁之王”的美稱（曾紹校等，2014）。以西番蓮為主要原材料，添加適量奶粉、胡蘿卜研制出的復合保健飲料，具有高維生素高優質蛋白的特點（殷建忠等，2005）。西番蓮果皮可提取色素和果膠，也可制作食用纖維和果脯;其種子含油率達21%～25%，用其壓榨出的食用油品質高、人體吸收率可達90%以上，有著非常高的營養價值和經濟前景（徐智和湯利，2012）。西番蓮葉片水提物具有抗炎作用（Montanher et al.， 2007），果肉和種子中的多酚成分具有良好的抗氧化特性（Lopez-Vargas et al.， 2013）;進一步的研究表明低劑量西番蓮地上部分提取物有較好的抗焦慮作用，而高劑量提取物有較好的鎮定作用（Deng et al.， 2010; Li et al.， 2011）。此外，西番蓮還具有抗腫瘤、清熱降火、止咳化痰等功能（Chen & Guo，1999; Liu et al.， 2017）。

最早在大腸桿菌（Eecherichia coli）中發現的ERA蛋白（E. coli Ras-like protein）普遍存在于原核和真核生物（Abu et al.， 1999），它是一類新的GTP結合蛋白亞家族，既在其N端有典型的GTPase保守結構域（GTPase domain），又在其C端有獨特的RNA結合結構域（KH domain），從而不同于異三聚體G蛋白和單體小分子G蛋白兩個亞族（Abu et al.， 1999;楊青青，2010）。植物中存在ERA的同源蛋白ERG（ERA-like GTPase），Ingram et al.（1998）首次報道了金魚草（Antirrhinum majus）的EGR蛋白及其編碼基因。擬南芥（Arabidopsis thaliana）基因組中存在兩個同源的ERG基因，AtERG1 和AtERG2（Suwastika et al.， 2014;Cheng et al.， 2018）。此外，在煙草（Nicotiana benthamiana）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）等高等植物中也存在包含兩個串聯重復的GTP結合結構域（GTP-binding domain）和一個CTD結構域（C-terminal domain）的DER蛋白（Double Era-like GTPase）（Jeon et al.， 2013;Cheng et al.， 2018）。這些ERG基因在植物的生長發育過程中發揮重要作用。

植物ERG蛋白定位于線粒體或葉綠體，它們在植物的生長發育過程中扮演重要角色（Ingram et al.， 1998;Suwastika et al.， 2014;Cheng et al.， 2018）。迄今，還沒有木本植物ERG基因克隆和功能驗證的相關報道。西番蓮抗寒新品種‘平塘1號，經受過2008年中國南方雪凝冰凍極端天氣的考驗，是目前選育出的唯一能在貴州喀斯特山區不經任何保暖防護措施而在零下溫度條件能順利越冬的西番蓮新種質。課題組前期開展了西番蓮抗寒性狀的分子調控模式研究（Liu et al.， 2017），差異基因表達譜分析發現，ERG基因參與調控西番蓮低溫應答響應。本研究以此為切入點，通過RACE技術克隆西番蓮ERG基因，開展該基因編碼蛋白質序列的同源性比對、保守結構域及系統進化分析，并利用實時定量PCR平臺檢測該轉錄本在低溫脅迫條件下的動態變化模式，為深入揭示ERG基因在植物生長發育和逆境應答響應中的生物學功能提供新思路。

1 材料與方法

1.1 植物材料及低溫脅迫試驗

西番蓮抗寒新品種‘平塘1號材料來自于貴州省平塘縣西番蓮種質資源庫（106°48′45.44″ E、 25°44′24.77″ N，海拔884 m），其不同組織器官根、莖、葉、花、果（R、S、L、Fl、Fr）采集于2年生的大田扦插苗。盆栽的1年生扦插苗，用于4 ℃低溫脅迫及25 ℃常溫恢復試驗，并在其低溫脅迫0 h（對照）、1 h（LST-1h）、4 h（LST-4h）、8 h（LST-8h）、24 h（LST-24h）、72 h（LST-72h）及其放置于常溫恢復1 h（NTR-1h）、4 h（NTR-4h）、8 h（NTR-8h）、24 h（NTR-24h）、72 h（NTR-72h）11個時間點取其葉片用于目的基因在低溫脅迫及常溫恢復過程中的表達譜分析。所用三個生物學重復的上述樣品經液氮速凍后保存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 總RNA提取與cDNA合成

采用天根生物科技（北京）有限公司提供的RNAprep Pure Plant Kit（TIANGEN，北京）抽提純化植物總RNA，并用寶生物工程（大連）有限公司的PrimeScriptTMRT Master Mix（TaKaRa，大連）進行反轉錄合成cDNA用于后續基因表達分析。

1.3 cDNA末端快速克?。≧ACE）

根據實驗室前期研究獲得的候選基因unigene序列（Liu et al.， 2017），設計PCR引物（表1），以‘平塘1號葉片cDNA為模板，開展候選基因片段的PCR擴增和測序驗證?；跍y序驗證獲得的基因片段序列設計RACE特異引物 （表 1）， 按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit操作指南進行3′-RACE和5′-RACE巢式PCR擴增，并經PCR產物回收、連接、轉化、測序和拼接，預測其開放閱讀框（open reading frame， ORF）。最后設計ORF擴增引物（表 1）， 完成ORF的PCR擴增和測序驗證。

1.4 生物信息分析

BioEdit軟件用于3′-RACE和5′-RACE序列比對拼接，ORF預測借助于FGENESH軟件。Expasy Protparma和ProtScale在線程序用于分析蛋白質分子量、理論等電點、氨基酸組成以及疏水性。蛋白質二級結構、三級結構、跨膜區、信號肽、亞細胞定位分別采用SPOMA、SWISS-MODEL、TMHMM 、SignalP 和Cell-Ploc2.0工具進行。序列多重比對使用Clustal X2軟件。系統進化樹構建采用MEGA7軟件中的鄰接（Neighbor Joining，NJ）法進行構建。

1.5 實時定量PCR

以來源于不同組織和不同時長低溫脅迫材料的cDNA為模板，使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑（Thermo Fisher Scientific，美國），在ViiA 7平臺上開展目的基因實時定量PCR檢測。每個樣品三次技術重復，以eIF-5A為內參（表1），采用 2-ΔΔCt 法進行相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 西番蓮PeERG基因cDNA全長序列分析

經3′-RACE和5′-RACE巢式PCR擴增、測序拼接及其ORF預測與測序驗證，最終獲得目的基因全長cDNA序列;經NCBI數據庫BLAST比對，該基因與其他植物ERG基因有較高同源性，故將其命名為PeERG。西番蓮PeERG基因cDNA全長為1 518 bp，包括38 bp的5′-端非翻譯區（5′-UTR）和220 bp的3′-端非翻譯區（3′-UTR），其ORF長度為1 260 bp （圖1）。PeERG基因在39～41位為起始密碼子ATG，下游存在同框終止密碼子TGA和polyA尾。

PeERG基因編碼420個氨基酸，預測其編碼蛋白質的相對分子量（MW）為 47.57 kD，理論等電點（pI）是5.53;帶負電荷殘基總數 （Asp+Glu） 為67個，帶正電荷殘基總數（Arg+Lys）為58個;不穩定指數（instability index） 為38.35，屬于穩定蛋白;總平均親水性（grand average of hybropathicity， GRAVY）為-0.431，預測該蛋白是親水性蛋白。蛋白質親疏水性序列譜見圖2：A，PeERG蛋白質同時具有疏水性和親水性區域，且親水性氨基酸殘基明顯多于疏水性氨基酸殘基。親水區域最高值（Score=-3.500）出現在第86～第91個氨基酸殘基， 疏水區域的最高值 （Score =2.689） 出現在第 A. 親疏水性序列譜; B. 二級結構; C. 三級結構模型。

2.2 PeERG蛋白高級結構預測

蛋白質跨膜區（TMHMM）和信號肽分析（SignalP）結果顯示，西番蓮PeERG基因編碼蛋白質序列不具有跨膜區域，也不存在信號肽酶切位點，推測其為非分泌、親水性蛋白。通過Cell-PLoc2.0在線軟件預測其定位于葉綠體。西番蓮PeERG蛋白存在有20個Ser、12個 Thr和8個Tyr 等可能的磷酸化位點（NetPhos）;其二級結構有37.62%的α-螺旋（alpha helix）、20.24%的延伸鏈（extended strand）、4.52%的β-轉角（beta turn）和37.62%的無規則卷曲（random coil）（圖2：B）。以 Swiss-Model Workspace上編號為3iev.1的模型作為模板，西番蓮PeERG蛋白質與其相似性較高的氨基酸位于120～414位（圖2：C）。

2.3 ERA蛋白質保守結構域分析

經NCBI數據庫BLAST序列比對發現，PeERG蛋白與其他物種的ERA蛋白具有較高的同源性，與擬南芥（Arabidopsis thaliana， AtDER、AtERG2、AtERG1）、大腸桿菌（Eecherichia coli， ERA、EcDER）和水稻（Oryza sativa， OsERG1）等ERA蛋白相似（圖3）。西番蓮PeERG蛋白N端有典型GTPase保守結構域，該結構域由G1、G2、G3、G4、G5五個box組成，能夠和鳥苷酸結合并水解GTP;同時在其C端有其特異的KH domain結構域，從而有別于異三聚體G蛋白和小分子G蛋白（small GTPase）兩個亞族。

2.4 ERA蛋白系統進化樹構建

為了探討ERA蛋白在細菌、真菌、植物和動物中的系統進化關系，我們將西番蓮（PeERG）、金魚草（ERG）、擬南芥（AtERG1， AtERG2， AtDER）、番茄（Solanum lycopersicum，SlERG）、馬鈴薯（Solanum tuberosum，StERG）、煙草（NtERG）、黃瓜（Cucumis sativus，CsERG）、玉米（Zea mays，ZmDER）、水稻（OsERG1， OsERG2， OsDER）、斑馬魚（Danio rerio，DrERA）、小鼠（Mus musculus，MmERA）、人類（Homo sapiens，ERAL1）、大腸桿菌（ERA， EcDER）13個物種的19個ERA（ERG）同源蛋白進行多重序列比對后構建系統進化樹（圖4）。西番蓮PeERG蛋白和水稻OsERG1、擬南芥AtERG1、大腸桿菌ERA位于同一進化分枝，PeERG與擬南芥AtERG1有更近的進化關系。

2.5 低溫脅迫下PeERG基因的表達模式分析

通過熒光定量PCR進行了西番蓮PeERG基因的組織表達差異分析，該基因在根、莖、花和果實中的表達量相當，而在葉中表達量最高（圖5：A）。西番蓮不同品種差異基因表達譜分析發現（Liu et al.， 2017），PeERA基因可能參與‘平塘1號抗寒性狀的分子調控。為了進一步揭示該基因低溫脅迫應答的表達模式，以盆栽的1年生‘平塘1號扦插苗為材料，開展西番蓮低溫脅迫及常溫恢復試驗，并在此過程中于11個不同時間點取其葉片材料用于PeERG基因相對表達量分析。在低溫脅迫及常溫恢復條件，西番蓮PeERG基因的表達僅有小幅度的波動，總體而言在0～24 h其表達先下降再上升，LST-4h是其低溫脅迫應答最低表達，24～72 h有所下降;在恢復處理的1～72 h時，PeERG基因的表達整體上呈現先下降再上升的趨勢，在NTR-8h為最低表達峰值（圖5：B）。

3 討論與結論

G蛋白是一類廣泛存在于真核細胞、具有內源GTP酶活性的鳥嘌呤核苷酸結合蛋白，在動植物細胞內跨膜信號轉導過程中起著“分子開關”的重要作用。ERA蛋白因其C末端存在與RNA或生物膜特異結合的KH domain結構域，有別于異三聚體G蛋白及小分子G蛋白，屬于一類新的GTP結合蛋白亞家族，不僅存在大腸桿菌、釀酒酵母，而且在高等動植物以及人類細胞中均含有其同源蛋白。在原核生物中，ERA蛋白在DNA復制、蛋白質翻譯以及細胞周期調控等生物學過程中發揮重要作用（Abu et al.， 1999;楊青青，2010）;而真核生物ERA基因起源于原核生物，兩者之間的蛋白序列具有較高相似性，動物ERA蛋白參與細胞周期調控、可能與腫瘤發生密切相關（楊青青，2010）。然而，有關高等植物ERG基因克隆和功能研究的相關報道尚少。

金魚草ERG蛋白定位于線粒體，可能通過影響線粒體的分裂參與調控植株受精作用后胚珠發育成種子的過程。金魚草ERG基因在各個組織器官中均有表達，其缺失突變體植株不能產生正常發育的種子（Ingram et al.， 1998;楊青青 2010）。擬南芥中存在AtERG1和AtERG2兩個ERA同源基因（楊青青，2011;Suwastika et al.， 2014），其編碼蛋白分別定位于葉綠體和線粒體。AtERG2基因主要在擬南芥葉脈、蓮座葉表皮毛、成熟花粉和胚珠，其編碼蛋白介導線粒體核糖體小亞基成熟及線粒體蛋白的翻譯而調控早期種子的形成和發育（Cheng et al.， 2018）。

溫度是決定植物地域分布的主要限制因素。西番蓮一般在熱帶及亞熱帶地區栽培，生長要求年平均氣溫在18 ℃以上，在低溫脅迫條件下西番蓮會遭到不同程度的傷害，而喀斯特山區適生品種‘平塘1號能在零下溫度條件可順利越冬。為什么‘平塘1號的抗寒性如此出眾？經過前期研究發現，ERG基因在不同西番蓮品種間顯著差異表達（Liu et al.， 2017）。以此為切入點，本研究首次從木本植物西番蓮中克隆和鑒定了ERG同源基因，研究發現PeERG基因在西番蓮抗寒新品種‘平塘1號的根、莖、葉、花、果中均有表達，葉中表達最高;在低溫脅迫及常溫恢復條件下該基因局限于低表達水平的動態變化;其編碼蛋白預測定位于葉綠體，具有類似大腸桿菌ERA蛋白、金魚草ERG蛋白、擬南芥AtERG1和AtERG2蛋白的四個保守G box和KH domain。PeERG基因在抗寒品種‘平塘1號低溫脅迫條件下，其轉錄表達并未被低溫誘導而顯著性上升或下降;推測該基因分別在抗寒品種和不耐寒品種內均為組成性表達模式，品種間的差異表達顯著，然而有關該基因具體的表達調控機制尚待深入研究。本研究首次在木本植物西番蓮中鑒定和描述了ERG基因序列特征和表達模式，不僅有助于進一步揭示其生物學功能和作用機制，也將為深入挖掘西番蓮特異種質資源提供理論基礎。

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（責任編輯 何永艷）