蒜頭果中CYP71基因克隆與果實不同發育時期的表達分析

原曉龍 陳中華 李云琴 王毅

摘 要： 由氨基酸衍生的氰苷是由植物細胞色素P450單加氧酶（CYP）催化氨基酸生成的次生代謝產物，與植物的防御和抗逆境脅迫相關。該研究通過分析蒜頭果轉錄組數據，從中分離并克隆得到1條細胞色素P450基因（命名為MoCYP71，GenBank登錄號為MK172858），對其進行生物信息學分析并檢測該基因在果實不同發育時期的表達情況。結果表明：MoCYP71基因含1 572 bp，編碼523個氨基酸，該基因的cDNA序列與咖啡（Coffea eugenioides，XM_027319282）、小果咖啡（Coffea arabica，XM_027213456）中的CYP71基因的mRNA序列均有88%的一致性;MoCYP71蛋白的相對分子質量為58 976.54，理論等電點pI為8.10，分子式為C2675H4184N704O744S27，不穩定系數（Ⅱ）為40.84，是一種不穩定蛋白;該蛋白不存在信號肽，存在于分泌途徑，含有兩個跨膜結構，分別位于20～37和311～333位的氨基酸為跨膜疏水螺旋，錨定于細胞器上;該蛋白含有CYP家族的保守結構域，包括脯氨酸富集區（PPSPPRLP）、K螺旋（KETFR）、I螺旋（GGIDTS）、PERF域（PERF）和識別結構域血紅素結合域（FGAGRRICPG），與可可、榴蓮、高粱等的CYP71E家族的蛋白（GenBank登錄號分別為EOX92908.1、XP_022773875.1和AAC39318.1）聚為一支;在花謝后，MoCYP71基因表達量逐漸降低， 花謝后1個月>2個月>3個月，但在花謝后4個月的表達量急劇增加。以上結果對研究蒜頭果的對蟲害的防御、組織成熟及蒜頭果中有效次生代謝產物的發掘具有重要意義。

關鍵詞： 蒜頭果， CYP71基因， 氰苷， 生物信息學分析， 基因表達

中圖分類號： Q781 ?文獻標識碼： A

文章編號： 1000-3142（2020）04-0501-08

Abstract： Amino acids-derived cyanogenic glucosides catalyzing by plant cytochrome P450 enzymes are plant secondary metabolism， which is related to plant defense and anti-stress. A gene of cytochrome P450（namely MoCYP71， GenBank ID is MK172858） from Malania oleifera was isolated and cloned through analyzing the transcriptome of M. oleifera， then its function was analyzed by bioinformatics analysis， and the expression of MoCYP71 in different developmental periods of fruit was detected. The results were as follows： MoCYP71 gene has 1 572 bp， encodes 523 amid acids， and its sequence of cDNA has 88% identity with the CYP71 cDNA of Coffea eugenioides（XM_027319282） and Coffea arabica（XM_027213456）; The relative molecular weight of MoCYP71 protein was 58 976.54， the theoretical pI was 8.10， the molecular formula was C2675H4184N704O744S27， the instability index（Ⅱ） was 40.84， and the protein belonged to an instable protein; There had no siginal peptide in this protein sequence， and the protein exists in the secretion pathway and contained two transmembrane structure， located in the protein sequences of 20-37 and 311-333， and the transmembrane sites anchored in the organelle membrane; MoCYP71 had all the conserved domain of CYP family， containing proline-rich region （PPSPPRLP）， K helix region（KETFR）， I helix region（GGIDTS）， PERF domain（PERF） and the main identified feature heme-binding region （FGAGRRICPG）， and the protein MoCYP71 and the CYP71E protein in Theobroma cacao， Durio zibethinus， Sorghum bicolor（GenBank ID is EOX92908.1， XP_022773875.1and AAC39318.1， respectively） clustered into one clan; The expression level of MoCYP71 gene reduced gradually in the first three months after blossom fading， particularly， 1st month the fruit after blossom fading> 2nd month> 3rd month， however， its expression level increased sharply in 4th month. The present study had a important significance to defense to insect pests， tissue ripening and secondary metabolism digging in Malania oleifera.

Key words： Malania oleifera， CYP71 gene， cyanogenic glucosides， bioinformatics analysis， gene expression

蒜頭果（Malania oleifera）隸屬于鐵青樹科（Olacaceae），為我國特有的單種屬瀕危植物，僅分布于云南東南部和廣西西部 （劉雄民等， 2007）。在蒜頭果果實的成熟期，其果實和枝葉中會含有少量苯乙腈、氰苯基苯甲酸類等氰苷類化合物 （Tang et al.， 2013）;這是因為植物成熟過程中需要合成乙烯，同時會產生少量氰苷類化合物 （Gleadow & Moller， 2014），而通常情況下植物中的氰苷能穩定地存在于細胞的區室中（Morant et al.， 2008），但當植物受到昆蟲等侵襲時，氰苷就會被降解成酮和氰化物以抵御其侵害（Anne Vinther et al.， 2008; Jorgensen et al.， 2011）。

氰化物是一類對人類具劇毒作用的化合物，急性氰化物中毒會抑制線粒體中的細胞色素aa3氧化酶的活性并阻斷細胞呼吸，嚴重時甚至危及生命（Nelson， 2006a）。氰苷的生物合成途徑首次在高粱（Sorghum bicolor）中闡明 （Jones et al.， 1999;Gleadow & Moller， 2014），高粱中氰苷類的生物合成途徑中僅包含3個結構基因，包括兩種生物膜錨定的多功能細胞色素P450（CYP79A1和CYP71E1）和一個可溶的UDPG-葡萄糖基轉移酶（UGT85B1） （Halkier et al.， 1995; Bak et al.， 1998; Jones et al.， 1999）。其中CYP79A1負責催化酪氨酸轉化成 p-羥基苯乙醛肟（p-hydroxyphenylacetaldoxime）;CYP71E1負責將p-羥基苯乙醛肟轉化成p-羥基苯乙醇腈，CYP71E1又名4-羥基苯乙醛肟單加氧酶（4-hydroxyphenylacetaldehyde oxime monooxygenase）（Xie et al.， 2017）; UGT85B1負責在p-羥基苯乙醇腈（p-hydroxymandelonitrile）上添加葡萄糖基生成蜀黍苷（dhurrin）。高粱中的CYP71E1酶屬于CYP71家族（Xie et al.， 2017），但CYP71家族中的基因存在大量新功能化或亞功能化的多重復制與重組，如雙子葉植物擬南芥（Arabidopsis thaliana） CYP71家族中的52個成員僅覆蓋了CYP71A和CYP71B兩個亞家族 （Paquette et al.， 2000; Nelson et al.， 2004）， CYP71家族同源基因的多樣性極為豐富（Jorgensen et al.， 2011），因此對CYP71家族基因的具體功能鑒定存在一定的困難。目前，研究人員從擬南芥（Bak et al.， 2001）、大豆（Guttikonda et al.， 2010）等多種植物分離得到多種CYP71家族基因，但尚未有關蒜頭果（Malania oleifera）方面CYP71基因的報道。本研究選擇生長3個月的蒜頭果果實進行轉錄組測序，從轉錄組數據中搜索獲得CYP基因（命名MoCYP71），采用RT-PCR技術克隆獲得該基因全長cDNA，并用生物信息學分析的方法對其潛在功能進行預測，再檢測該基因在果實的不同發育時期的表達量，為進一步研究蒜頭果果實中次生代謝物質的生物合成、揭示對非生物和病原體脅迫的防御機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從生長于云南省文山州廣南縣舊莫鄉巖臘村的蒜頭果上分別采集花謝后1個月、2個月、3個月、4個月的果實，同時采集葉片作為對照;迅速將所采集的樣品放入液氮中保存，帶回實驗室置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2 轉錄組分析與RNA提取

將花謝后3個月的蒜頭果果實送到華大基因進行轉錄組測序，通過對轉錄組Unigene進行本地Blast，并將各Unigene在NR、NT、Swiss-Prot、KEGG、COG、GO等數據庫中進行注釋和分析，尋找蒜頭果果實轉錄組中的CYP71基因。按照Qiagen Plant RNA提取試劑盒說明書的步驟提取蒜頭果果實和葉片的總RNA，用1%的瓊脂膠檢測所有樣品RNA的完整性。再取1 μg 符合試驗要求的RNA進行反轉錄得到cDNA，將cDNA保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.3 蒜頭果MoCYP71基因克隆

通過對蒜頭果轉錄組數據分析，獲得表達量高且擁有完整開放閱讀框的CYP基因，以獲得的CYP基因序列，設計含有起始密碼子的特異引物（MoCYP71F：5′-ATGCACTTGAGCTTCCAAAG-3′）和含有終止密碼子的特異引物（MoCYP71R： 5′-GGTATAATTGGGATGCATAG-3′）。以蒜頭果果實cDNA 為模板，用HiFi高保真聚合酶進行PCR擴增，電泳檢測后通過將目的片段連接到pGMT載體上、轉化、菌落PCR篩選獲得含MoCYP71基因的陽性克隆，送上海生工測序，最終通過序列比對確定獲得MoCYP71基因全長cDNA，并永久保存在-80 ℃冰箱。

1.4 MoCYP71的生物信息學分析

用ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）對CYP71基因進行翻譯獲得其蛋白序列，用ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）等分析MoCYP71蛋白的理化性質、保守結構域和跨膜結構域，并用DNAMAN比對其氨基酸同源序列，確定MoCYP71的保守結構域。將蒜頭果MoCYP71蛋白與NCBI上已知的其他植物的CYP蛋白進行多重比對，并用MEGA7軟件中鄰位相接法（Neighbor-joining）構建分子系統進化樹。

1.5 蒜頭果MoCYP71基因不同組織表達分析

分別取蒜頭果不同組織的RNA 2 μg，反轉錄合成cDNA第一條鏈。以不同組織的cDNA為模板，用特異引物TMoCYP71F（5′-ACCGCCGTCGCCCAATCTTC-3′）和TMoCYP71R（5′-AACAGAGCATGAGGACTTGG-3′）進行熒光定量PCR分析，并以elongation factor 1-alpha基因作為內參基因。具體反應體系如下：分別向PCR管中加入2×SYBR Green master mix（含ROX） 12.5 μL、 引物TMoCYP71F和TMoCYP71R各0.5 μL、cDNA 1 μL，最終用PCR water nucle-free補足25 μL。PCR反應條件：首先，預變性溫度95 ℃，時間10 min;然后，變性溫度95 ℃，時間15 s;最后，退火和延伸溫度為 60 ℃，時間為30 s，共40個循環。反應結束后，收集信息做Ct值分析。

2 結果與分析

2.1 蒜頭果MoCYP71基因的克隆

通過對蒜頭果轉錄組數據的分析，獲得一條植物細胞色素P450相關的DNA序列，并以其為基礎設計特異引物MoCYP71F和MoCYP71R，以蒜頭果果實的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得一條長1 572 bp的cDNA序列（圖1），將其命名為MoCYP71基因（GenBank登錄號為MK172858）。將MoCYP71基因的cDNA序列在NCBI上進行Blast比對，發現該基因的cDNA序列與咖啡（Coffea eugenioides，XM_027319282）、小果咖啡（Coffea arabica，XM_027213456）中編碼植物細胞色素P450基因的mRNA序列均有88%的一致性。

2.2 MoCYP71基因及其蛋白的生物信息學分析

MoCYP71基因可編碼523個氨基酸，將其氨基酸序列在NCBI上進行Blast比對，發現該蛋白與高粱（Sorghum bicolor）中編碼4-羥苯乙酮肟單加氧酶（Bak et al.， 1998）（4-hydroxyphenylacetaldehyde oxime monooxygenase，EC：1.14.14.37）的細胞色素P450蛋白（GenBank登錄號為AAC39318.1）的一致性為58%，4-羥苯乙酮肟單加氧酶屬于CYP71家族。MoCYP71的生物信息學分析結果顯示，該蛋白的相對分子質量為58 976.54，理論等電點pI為8.10，分子式為C2675H4184N704O744S27，不穩定系數（Ⅱ）為40.84，是一種不穩定蛋白;該蛋白不存在信號肽，存在于分泌途徑，含有兩個跨膜結構，分別位于20～37和311～333位的氨基酸為跨膜疏水螺旋，錨定于細胞器上。將蒜頭果的MoCYP71蛋白與高粱、木薯（Manihot esculenta）和擬南芥（Arabidopsis thaliana）的CYP71家族蛋白（GenBank登錄號分別為O48958、Q6XQ14和Q9LVD2.1）進行同源序列比對，發現MoCYP71蛋白具植物細胞色素P450的所有保守結構域（圖2），脯氨酸富集區（PPSPPRLP）、K螺旋（KETFR）、I螺旋（GGIDTS）、PERF域（PERF）和CYP超酶家族的典型識別結構域血紅素結合域（FGAGRRICPG）。選擇已鑒定過功能的可可（Theobroma cacao）、中華獼猴桃（Actinidia chinensis var. chinensis）、高粱等的4-羥苯乙醛肟單加氧酶 （GenBank登錄號分別為EOX92908、PSR86236 和AAC39318）;大豆（Glycine max）、梅（Prunus mume）和鱷梨（Persea americana）等屬于苯醛肟加氧酶的蛋白（GenBank登錄號分別為AF022157、AB920492和P24465）;菊苣（Cichorium intybus）、黃花蒿（Artemisia annua）、埃及莨菪（Hyoscyamus muticus）和煙草（Nicotiana tabacum）等的萜類合成酶蛋白（GenBank登錄號分別為E1B2Z9、BAM68808、ABS00393和AAD47832）;長春花（Catharanthus roseus）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、向日葵（Helianthus annuus）和大阿米芹（Ammi majus）等的吲哚類物質的生物合成酶蛋白（GenBank登錄號分別為ADZ48681、O49342、AEI59779和Q6QNI4 ）與蒜頭果的MoCYP71蛋白一起構建分子系統進化樹，圖3結果顯示：蒜頭果與可可、中華獼猴桃和高粱等的4-羥苯乙醛肟單加氧酶（CYP71E1）蛋白聚為一支，該組中蛋白負責催化4-羥苯乙醛肟轉化為4-羥基苯乙醇腈。

2.3 MoCYP71基因在不同果實發育時期和葉片中的表達分析

以不同發育時期的蒜頭果果實、葉片的cDNA為模板，以特異的檢測引物TMoCYP71F和TMoCYP71R檢測MoCYP71基因的具體表達量，圖4結果顯示：MoCYP71基因在不同發育時期的蒜頭果果實及葉片中均有表達，以葉片（L）的表達量為參照，MoCYP71基因在不同發育時期果實中表達量均高于參照;在花謝后，MoCYP71基因表達量逐漸降低， 花謝后1個月（F1）>2個月（F2）>3個月（F3），但在花謝后4個月（F4）的表達量急劇增加。Mo. 蒜頭果CYP71蛋白; Sb. 高粱（Sorghum bicolor）CYP71蛋白（AAC39318.1）; Me.木薯（Manihot esculenta）CYP71蛋白（Q6XQ14.1）; At. 擬南芥（Arabidopsis thaliana）CYP71蛋白（Q9LVD2.1）。

3 討論與結論

蒜頭果的揮發油中扁桃腈的相對含量高達64.98 %（黃開響等， 2008），扁桃腈是由氫氰酸添加葡萄糖生成 （Rustler et al.， 2007）。氰苷是一類廣泛存在于植物中的次生代謝產物，其生物合成是由細胞色素P450單加氧酶（CYP）催化氨基酸形成（Bak et al.， 1998），其中CYP79家族催化脂肪族或芳香族氨基酸形成相應的醛肟（Gleadow & Moller， 2014），CYP71催化醛肟生成相應的氰苷（Bak et al.， 1998）。目前，已有CYP79和CYP71E酶在高粱（Bak et al.， 1998）、木薯（Jorgensen et al.， 2011）、紅豆杉（Taxus baccata）（Luck et al.， 2017）中參與氰苷生物合成的報道。迄今為止，尚未有關在蒜頭果中參與氰苷生物合成的CYP家族基因的報道。

本研究從蒜頭果中克隆獲得CYP71家族的基因MoCYP71，通過生物信息學分析發現該基因的蛋白與其他植物細胞色素P450家族的蛋白理化性質、結構域、識別位點、細胞定位和跨膜結構等，與其他植物CYP71蛋白的研究結果相似（Boutanaev et al.， 2015; Sharafeldin et al.， 2017）。根據蛋白序列的一致性可將CYP71家族分成許多分支，其中蛋白序列一致性在40%屬同一家族、高于55%屬同一亞家族，高于97%則屬于等位基因突變體（Nelson， 2006b; Liu et al.， 2016）; MoCYP71與高粱中編碼4-羥基苯乙醛肟單加氧酶（Bak et al.， 1998）的蛋白一致性為58%，可推測MoCYP71為4-羥基苯乙醛肟單加氧酶 （Xie et al.， 2017）。本研究通過聚類分析將CYP71蛋白分成4個具不同催化功能的分支，是因為CYP71家族基因在植物的進化過程中分化多樣（Jorgensen et al.， 2011）;該聚類分析中MoCYP71蛋白與可可、中華獼猴桃、高粱等編碼4-羥基苯乙醛肟單加氧酶的蛋白聚為一支，MoCYP71蛋白可能為4-羥基苯乙醛肟單加氧酶，其催化功能可能為將4-羥苯乙醛肟催化為4-羥苯乙醇腈;其余分支分別為苯醛肟單加氧酶、萜類單加氧酶及吲哚類羥化酶。基因表達分析顯示MoCYP71基因在花謝后前3個月的蒜頭果果實中的表達量逐漸降低，而在第4個月的表達量急劇增高，推測該基因與蒜頭果果實成熟存在一定關聯。綜上所述，MoCYP71基因參與氰苷的生物合成、與蒜頭果成熟有關;這與CYP71基因參與組織成熟，在乙烯生物過程中會形成少量氰苷（Gleadow & Moller， 2014）的研究結果一致，高粱中CYP71E1基因的表達與MoCYP71基因表達類似，即在成熟前CYP基因表達逐漸降低，而在成熟期迅速躍升的現象（Bozak et al.， 1990; Jones et al.， 1999; Gleadow & Moller， 2014）。當植物組織損傷時，氰苷可水解為氰酸、腈等有毒物質（Irmisch et al. 2014）以保護成熟組織免遭食草動物侵害，MoCYP71基因在蒜頭果果實不同發育時期的表達亦證明了這一現象。本研究通過對蒜頭果轉錄組的分析分離并克隆得到MoCYP71基因，對其進行生物信息學分析并檢測其在不同的果實發育時期的具體表達量，為蒜頭果的防御機制和蒜頭果成熟研究奠定基礎。

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（責任編輯 周翠鳴）