補腎活血顆粒指紋圖譜試驗研究

李靜，張文理 ，張偉，王冰，王偉

（1 青島市中醫醫院，山東 青島；2 山東中醫藥大學，山東 濟南；3 青島市中心醫院，山東 青島）

0 引言

為提高藥品質量，保證用藥療效，對補腎活血顆粒進行高效液相特征指紋圖譜試驗研究，并對其特征指紋圖譜中可辨析的19 個共有峰中的5 個色譜峰進行了成分標定和藥材來源初步歸屬，為全面控制該制成品制劑質量提供了依據。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Agilent 1100 型高效液相色譜儀，包括G1322A 型在線脫氣機，G1313A 型自動進樣器，G1315A 型DAD 檢測器，G1316A 型柱溫箱（美國Agilent 公司）；CPA225D 型十萬分之一電子分子天平（德國Sartorius 有限公司）；Agilent HCC18 色譜柱(4.6×250 mm，5 μm)。

1.2 試藥

丹參酮ⅡA 對照品（批號：110766-201520）；芍藥苷（批號：110736-201438）；馬錢苷（批號：11640-201606）；補骨脂素（批號：110739-201617）；黨參炔苷（111732-201206）；梓醇（110808-201210）；異補骨脂素（批號：0738-201313）；丹參素鈉（110855-201412）；齊墩果酸（批號：0709-9803）均購自中國食品藥品檢定研究院。

13 批次補腎活血顆粒批號為S1(160722)、S2(160723)、S3(160724)、S4(160725)、S5(160726),S6(160728),S7(160729)、S8(160730) 、S9(160731)、S10(160801) 、S11(160802)、S12(160803)、S13(160804)，甲醇、乙腈為色譜純（天津市四友精細化學品有限公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

黑順片（產地：陜西 批號：150901）；酒山茱萸（產地：浙江 批號：201511010）炒葶藶子（產地：河北 批號：201505010）；鹽補骨脂（產地：江蘇 批號：151002）； 熟地黃（產地：201510062 批號：201510062）； 赤芍（產地：內蒙古 批號：201511035）；大棗（產地：河北 批號：150901）；黨參（產地：甘肅 批號：160116）；黃芪（產地：內蒙古 批號：151016）；丹參（產地：山東 批號：151112）。

處方藥材來自青島市海慈醫療集團藥劑科中草藥房（浙江安國市平安藥業有限公司），經本院張偉主任中藥師鑒定符合2015 年版《中國藥典》相關項下要求。

2 試驗部分

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Agilent HC-C18 (4.6×250 mm，5 μm)；流 動相：乙腈(A)-水(B)，按表1 程序進行梯度洗脫；流速：0.8 ml/min；檢測波長：230 nm；柱溫：25 ℃；進樣體積：6 μl。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取丹參酮ⅡA、芍藥苷、馬錢苷、補骨脂素、異補骨脂素0.5 mg，置10 ml 容量瓶中，加適量甲醇超聲處理40min 使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備

取本品1 袋（約10 g），研細，精密稱取約1.5 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入90% 甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理40min，放冷，再稱定，用90%甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 十味藥材溶液的制備

分別各取黑順片、酒山茱萸、炒葶藶子、鹽補骨脂、赤芍、熟地黃、大棗、黨參、黃芪、丹參適量，粉碎，置于具塞錐形瓶中，分別加90%甲醇40 ml，超聲處理40min，濾過，取續濾液分別作為每味藥材的提取液。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗

取S3 號樣品供試品溶液，連續進樣6 次，以9 號峰（芍藥苷峰）作參照峰，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果，各共有峰相對保留時間 RSD 在0.33%-1.69%之間，相對峰面積RSD 在1.03%-3.51%之間，顯示該方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗

取S3 號樣品9 份，制備成供試品溶液進行試驗。以9 號峰（芍藥苷峰）作為參照峰，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果顯示，各共有峰相對保留時間RSD 為0.41%-1.77%，相對峰面積的RSD 是1.07%- 3.12%，顯示方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗

取S3 號樣品的供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h 進樣測定。以9 號峰（芍藥苷峰）作為參照峰，考察各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的一致性。結果顯示，各共有峰的相對保留時間的RSD 為0.53%-1.66%，相對峰面積的RSD 為1.18%-3.94%，表明供試品在24h 內穩定性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

2.4.1 圖譜采集

依次精密吸取各供試品溶液、各單一對照品溶液、混合對照品溶液、單味藥材溶液各5 μl，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。

2.4.2 共有峰的標定

按“2.1”項下方法，對13 批補腎活血顆粒樣品進行試驗，觀察所得指紋圖譜，選取吸收信號較強、穩定性好、峰形明顯的19 個色譜峰，確定為共有峰。其中9 號峰（芍藥苷峰S）吸收強，峰面積大，受其他峰干擾少，成分確定，故取其作為補腎活血顆粒指紋圖譜的參照峰S。以9 號峰的保留時間和色譜峰面積為1，計算共有峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.4.3 共有峰的指認

采用對照品對照法對混合對照品HPLC 圖譜共有峰進行指認，以相對保留時間為判斷依據，19 個共有峰可以指認5 個成分峰，比對指認出馬錢苷、芍藥苷、補骨脂素、異補骨脂素、丹參酮ⅡA。

2.4.4 樣品相似度評價

采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統 (2012.130723 版本)，以對照譜圖上標示的色譜峰作為匹配點，進行多點校正，并計算結果，13 批補腎活血顆粒指紋圖譜的相似度在 0.926-0.971 之間，平均值為0.949，RSD 值為1.65%。

3 討論

《國家藥品標準技術規范》中規定，中藥指紋圖譜系指中藥經適當處理后，采用一定的分析方法得到的能夠體現中藥整體特性的圖譜[1]。

中藥質量控制是中藥現代化研究的核心問題之一。隨著科技的不斷發展,中藥的質量控制由傳統的單憑經驗鑒別氣味、口感、色澤等逐步發展到薄層、紫外、紅外、熒光、色譜等技術的應用。雖然高效液相法得到了廣泛的應用,但也局限在單一成分定量上。中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段,它是建立在中藥化學成分系統研究的基礎上,主要用于評價中藥材以及中藥制劑半成品、成品質量的真實性、優良性和穩定性[2]。

（1）本實驗對梓醇、丹參素鈉、齊墩果酸、黨參炔苷也進行了對照品定性研究，但由于其在本流動向下未出峰或與其他重合，因此不能將其作為定性研究對照[3]。

（2）經查閱文獻資料，匯總優選出處方中藥材的類似流動相以及多數共同的檢測波長，在優選波長230 nm 下通過實驗，選出各流動相的持續沖柱時間，使之在圖譜中出現的色譜峰呈現多樣性。

（3）本實驗對補腎活血顆粒進行了指紋圖譜定性分析方法的初步探索，該方法簡單可靠，此方法可以快速檢測顆粒中的藥材和化學成分，并為之后的指紋圖譜定量分析研究打下基礎[4-8]。