特丁噻草隆降解菌的分離鑒定及降解特性

任建軍 牛東澤 湯姚 張晉 田英申 李春雨

關鍵詞：特丁噻草隆;降解菌;生物降解

中圖分類號：S482.4文獻標識碼：A文章編號：1000-4440（2020）02-0526-03

Key words：tebuthiuron;degrading bacteria;biodegradation

隨著現代農業的不斷發展，農藥被廣泛應用于病蟲害的防治中，這極大地提高了糧食產量。但是，農藥的頻繁使用和超劑量施用會導致土壤中農藥殘留量超標，特別是新型農藥具有熱穩定性強、不易光解等特點，很難在自然條件下快速降解[1-2]。土壤中的農藥殘留不僅影響食品安全，也給人畜的生活環境和健康帶來了巨大威脅[3]。因此，有效解決土壤中農藥殘留帶來的污染問題已迫在眉睫。

目前，常用的土壤農藥殘留修復技術包括物理修復技術、化學修復技術和生物修復技術。但是，物理修復技術和化學修復技術主要用于修復工業污染農田的土壤[4]，因其存在設備昂貴，處理成本高，可能產生二次污染等問題，所以很少用于修復農藥污染的農田土壤[5]。生物修復技術具有成本低，無二次污染，可以改善土壤結構等優點，能夠降解農藥等大多數有機污染物，可將污染物徹底分解為二氧化碳、水、無機化合物等對環境和人畜無害的物質[6-7]。

特丁噻草隆是一種滅生性的雜環取代脲類除草劑[8]，因其具有藥效高、毒性小等特點而被用于控制多種農林作物的雜草，并且因其在土壤和水體中的高溶解度、低生物降解性及潛在的可致癌性，受到學者的廣泛關注[9]。但是，目前關于特丁噻草隆微生物降解的研究較少。因此，本研究擬篩選特丁噻草隆的高效降解菌，并研究其對特丁噻草隆的降解特性，以期為特丁噻草隆污染的修復提供方法和理論依據。

1材料與方法

1.1供試儀器及試驗材料

特丁噻草隆純品及主要化學試劑（分析純）購自國藥集團化學試劑有限公司，分子生物試劑購自寶生物工程（大連）有限公司，細菌基因組DNA提取試劑盒購自于南京奧青生物技術有限公司。土壤樣品由河北慈心環保科技有限公司提供，采集于長期施用特丁噻草隆的農田以及特丁噻草隆生產工廠排污口的污泥。試驗主要器材包括：恒溫搖床、電泳儀、自動凝膠圖像分析儀、恒溫培養箱、高速離心機、高壓滅菌鍋、通風干燥箱、超純水儀、紫外分光光度計、高效液相色譜儀、氣相色譜-質譜聯用儀。

基礎鹽培養基：KH2PO4 0.5 g、K2HPO4 1.5 g、NaCl 1.0 g、（NH4）2SO4 2.0 g、MgCl2 0.1 g、去離子水1 000 ml、pH 7.0，以特丁噻草隆為碳源，根據需要調整特丁噻草隆的濃度，基礎鹽固體培養基為基礎鹽培養基中再添加1.5%的瓊脂。Luria-bertani（LB）培養基：酵母粉5.0 g、氯化鈉10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、去離子水1 000 ml，LB固體培養基為LB培養基中再添加1.5%的瓊脂。

1.2試驗方法

1.2.1富集與分離

取5 g特丁噻草隆污染土樣，加入特丁噻草隆質量濃度為100 mg/L的基礎鹽培養基中，置于37 ℃、180 r/min條件下培養7 d，以3%的接種量將其接入相同的培養基中，傳代3次。取1 ml富集培養物分別進行梯度（1×10-5、1×10-6、1×10-7）稀釋，用移液槍吸取100 μl，分別涂布于特丁噻草隆質量濃度為100 mg/L的基礎鹽固體培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養35 d，選擇有透明光圈的菌落在LB固體培養基上劃線培養，挑取單菌落，通過培養得到純化菌株。

1.2.2菌株鑒定

通過16S rRNA基因序列鑒定純化菌株的種屬[10]。以降解菌的基因組DNA為模板，擴增16S rRNA基因，用16S通用引物，即27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′。25.00 μl擴增體系為：10×Buffer 2.50 μl，脫氧核糖核苷三磷酸（2.5 mmol/μl） 2.00 μl，引物（25.0 mmol/μl）各0.75 μl，MgCl2（25.0 mmol/μl） 2.50 μl，模板DNA 0.25 μl，rTaq DNA聚合酶（5 U/μl） 0.20 μl，用雙蒸水（ddH2O）補齊至25.00 μl。聚合酶鏈式反應（PCR）條件為：95 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，循環35次，72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物送至生工生物工程（上海）股份有限公司完成測序，基因序列在NCBI上進行Blast比對分析，并與GenBank中其他菌株的16S rRNA基因序列進行同源性比較，利用Mega 6.0軟件構建系統進化樹。

1.2.3特丁噻草隆質量濃度的測定

發酵樣品過濾后，用高效液相色譜法（HPLC）進行檢測[8]，條件為：C18（250.0 mm×4.6 mm，長度×內徑）不銹鋼柱，流動相是甲醇+0.1%甲酸/超純水（75/25，體積比），流速為1.0 ml/min，進樣體積為10 μl，柱溫為25 ℃，保留時間為5 min，檢測波長為255 nm。根據標準曲線方程Y=0.971 8x-2.746 6（R2=0.998 7）計算特丁噻草隆的質量濃度。

1.2.4降解菌生長狀況和降解性能的測定

將篩選出的降解菌及其混合菌（等量混合）分別按0.5%接種于含400 mg/L特丁噻草隆的基礎鹽培養基中，置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養7 d，測定特丁噻草隆的質量濃度和OD600的吸光值。

1.2.5吐溫-80對特丁噻草隆降解率的影響

將篩選出的降解菌及其混合菌分別按0.5%接種于含400 mg/L特丁噻草隆和0.5%吐溫-80的基礎鹽培養基中，置于37 ℃、180 r/min恒溫搖床中培養7 d，測定特丁噻草隆的質量濃度，并計算降解率。

1.2.6數據處理

利用DPS軟件對數據進行統計分析，并用ANOVA方法進行多重比較，采用Duncans方法檢驗差異顯著性。

2結果與分析

2.1特丁噻草隆降解菌的篩選與鑒定

本試驗從受污染的土樣中篩選出15種菌株，對其進行富集馴化、分離純化、初篩和復篩，最終選出了4株能在以特丁噻草隆作為唯一碳源的選擇性培養基上生長的菌株，并將其分別命名為T2-1、T2-2、T2-3和T2-4。以菌株的總DNA為模板，擴增16S rRNA基因片段1.5 kb左右。將測序結果提交至NCBI在線Blast上，并用16S rRNA基因序列構建進化樹，結果表明，T2-1為殺香魚假單胞菌（Pseudomonas plecoglossicida），T2-2為臺灣銅綠假單胞菌（Cupriavidus Taiwanensis），T2-3為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），T2-4為施氏假單胞菌（Pseudomonas stutzeri）。

2.2降解菌的生長和降解性能

不同降解菌對特丁噻草隆降解性能的研究結果表明，降解菌T2-1、T2-2、T2-3、T2-4和混合菌對特丁噻草隆的降解量分別為11.39 mg/L、11.53 mg/L、10.95 mg/L、7.38 mg/L和15.27 mg/L，對應的降解率分別為0.028 5、0.028 8、0.027 4、0.018 5和0.038 2。由此可知，混合菌的降解效果最好，在單菌降解中，T2-1和T2-2的降解效果較好。不同降解菌在降解培養基中的生長情況表明，降解菌T2-1、T2-2和T2-4的菌體生物量增長明顯，而T2-3和混合菌的菌體生物量幾乎沒有變化。

2.3 ?吐溫-80對降解菌降解特丁噻草隆效果的影響

結果表明，降解菌T2-1、T2-2、T2-3、T2-4和混合菌在添加0.5%吐溫-80的基礎鹽培養基中，降解量分別為20.12 mg/L、27.37 mg/L、23.89 mg/L、23.20 mg/L和32.43 mg/L，對應的特丁噻草隆降解率分別為0.050 3、0.068 4、0.059 7、0.058 0和0.081 1。由此可知，吐溫-80能夠明顯提高降解菌對特丁噻草隆的降解率。

3討論

用于農藥殘留生物修復的微生物包括芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、克雷伯氏菌屬、黃單胞菌屬等[10-11]。假單胞菌是重要的生物降解資源[11-13]。本研究篩選出4株降解菌，包括殺香魚假單胞菌、臺灣銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌，均可用于降解環境中的特丁噻草隆等有機污染物。除此以外，假單胞菌還可以用于生物防治，是具有潛力的生物防治菌種資源[9，14]。微生物降解農藥等有機污染物的本質是一系列酶促反應，單一微生物往往不具備降解有機物所需要的全部酶，因此，多種微生物協同作用能夠加快有機污染物的降解。有研究結果表明，紅球菌屬和假單胞菌屬混合培養可以明顯提高氯氰菊酯的降解率[15-16]。本研究發現，殺香魚假單胞菌、臺灣銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌和施氏假單胞菌混合后對特丁噻草隆的降解率更高。表面活性劑充分保證了底物與微生物的接觸，有利于微生物的降解作用[17]。本試驗發現，吐溫-80能提高假單胞菌對特丁噻草隆的降解率。

盡管本研究對分離菌株的降解率進行了研究，但特丁噻草隆的生物降解途徑和代謝產物尚不明確。在今后的研究中，可以改進代謝產物的提取方法，優化檢測系統，進一步探索其降解機理，同時優化降解條件，更好地促進其在特丁噻草隆污染修復中的應用。

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（責任編輯：王妮）