Nisin及納他霉素生物保鮮劑對干豆腐保鮮效果的研究

楊立娜，趙亞凡，馬丹丹，朱丹實，朱力杰，王勝男，馬濤，何余堂，劉賀 ，*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心，遼寧錦州121013；2.北京工商大學，中加食品營養與健康聯合實驗室，北京100048）

豆制品是我國非常重要的一類傳統食物，含有豐富的蛋白質、維生素以及鐵、鈣、磷、鎂等多種微量元素[1]，深受廣大消費者的喜愛。干豆腐作為豆制品種類之一，含有人體必需的8種氨基酸，其含有的卵磷脂可以降低血液中膽固醇含量，減少動脈粥樣硬化的發生，有效預防心血管疾病，保護心臟[2]；干豆腐中的多種礦物質可以有效預防因缺鈣引起的骨質疏松，促進骨骼發育[3]。從我國目前豆制品生產與貯藏的發展現狀來看，依然存在一些問題，干豆腐含水量高、易粘連，極易被金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等食源性病原菌污染[4]，使得豆制品存在著嚴重的安全隱患，大大縮短了產品的貨架期。在夏季干豆腐更容易變質，給消費者帶來了許多不便。因此，干豆腐的保鮮尤為重要。

山梨酸鉀、苯甲酸鈉、乳酸鏈球菌素以及納他霉素均為食品中常用的保鮮劑[5]，山梨酸鉀能有效地抑制霉菌、酵母菌以及一些好氧性細菌的活性，但對于嗜酸乳桿菌等一些微生物基本無效，具有一定的局限性[6]；而苯甲酸鈉的防腐綜合效果不及山梨酸鉀且使用過程中同樣存在局限性。相比來說，乳酸鏈球菌素（Nisin），是乳酸鏈球菌產生的一種多肽物質，由34個氨基酸殘基組成[7]，通過干擾細胞膜的正常功能，造成細胞膜的滲透，養分流失和膜電位下降，從而導致致病菌和腐敗菌細胞的死亡，并且食用后在人體內很快會水解成氨基酸，不會造成人體腸道內正常菌群的紊亂[8]，可廣泛應用于肉制品、乳制品、方便食品等領域中[9]。納他霉素作為一種多烯烴大環內酯類抗真菌劑[10]，能有效抑制酵母菌和霉菌的生長[11]，可用其對食品表面進行處理以延長食品的保質期[12]，同時并不影響食品的風味和口味。同時趙春燕[13]等研究不同濃度的Nisin、納他霉素以及二者復配保鮮劑對冷卻肉的保鮮效果表明Nisin和納他霉素同時使用時，其保鮮效果要優于單獨使用，二者之間存在協同作用。

本文主要采用Nisin和納他霉素作為保鮮劑，探究Nisin、納他霉素和Nisin-納他霉素復配保鮮劑對干豆腐貯藏的保鮮效果[14]，通過分析干豆腐貯藏期間理化指標、微生物指標及風味成分的變化，明晰Nisin-納他霉素復配生物保鮮劑對干豆腐貯藏品質的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干豆腐：市售；Nisin、納他霉素：廣州碩洋食品科技有限公司；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

生化培養箱（LRH）：上海一恒科技有限公司；電子天平（PL602-L）、酸度計（pHC-3）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD）：蘇景集團蘇州安泰技術有限公司；立式高壓滅菌鍋（MLS-3030CH）：三洋電機（廣州）有限公司；電子鼻（PEN3）：德國AIRSENSE公司；色彩色差計（CR-400）：杭州祥盛科技有限公司。

1.3 樣品處理與分組

稱取新鮮的干豆腐4份，每份100 g。每份噴涂不同的保鮮劑進行保鮮處理，對照組：噴灑5 mL無菌水；Nisin組：噴灑5 mL Nisin保鮮劑；納他霉素組：噴灑5 mL納他霉素保鮮劑；Nisin-納他霉素組：噴灑5 mL Nisin-納他霉素復配保鮮劑。

1.4 工藝流程

干豆腐→稱重→保鮮劑噴涂→瀝干→封口包裝→37℃貯藏

1.5 操作要點

1.5.1 保鮮液的配置

分別稱取0.01 g的Nisin和0.007 5 g的納他霉素，使用無菌水定容到10 mL，配制Nisin保鮮劑和納他霉素保鮮劑，再按濃度比例為4∶3配成Nisin與納他霉素復配保鮮劑。

1.5.2 保鮮液噴涂

將干豆腐展開攤在操作臺上，將干豆腐正反兩面均勻噴涂保鮮劑，每100 g干豆腐噴涂5 mL保鮮劑。

1.5.3 包裝

將噴涂好的干豆腐瀝干后裝于食品袋中，用封口機封口。

1.5.4 成品

將包裝好的干豆腐置于37℃恒溫培養箱中，用于后續指標的檢測。

1.6 各項指標測定方法

1.6.1 感官評價

聘請食品科學與工程專業學生10名組成評價小組進行評分，含色澤、滋味、氣味和組織狀態[15]，具體評分標準如表1。

表1 感官指標評價標準Table 1 Sensory index evaluation criteria

續表1 感官指標評價標準Continue table 1 Sensory index evaluation criteria

1.6.2 揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）的測定

根據GB 5009.228-2016《食品安全國家標準食品中揮發性鹽基氮的測定》的微量擴散法進行測定[16]。

1.6.3 菌落總數的測定

根據GB 4789.2-2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數測定》測定[17]。

1.6.4 pH值的測定

根據GB 5009.237-2016《食品安全國家標準食品pH值的測定》對樣品的pH值進行測定[18]。

1.6.5 揮發性氣味的測定

把干豆腐切碎，稱取5 g置于50 mL小燒杯中，用保鮮膜封住，靜置30 min后進行電子鼻檢測，每組樣品重復檢測3次。電子鼻參數[19]：傳感器清洗時間100 s，調零時間10 s，進樣準備時間5 s，樣品采集時間100 s，進樣流速為350 mL/min。使用PEN3電子鼻自帶WinMuster軟件中的主成分分析法（principal component analysis，PCA）和線性判別法（linear discriminant analysis，LDA）對干豆腐揮發性氣味的指標信息進行分析處理。將不同處理的4組樣品進行比較，在當天（即第0天），樣品保持新鮮的狀態下，用電子鼻吸附燒杯內部空間氣味方法獲取數據[20]，即為新鮮組，再用PCA和LDA分析法對4組樣品進行分析。

1.6.6 色差的測定

利用色差計對干豆腐表面L*，a*，b*進行測定，L*代表明亮度，a*，b*分別代表赤色度和黃色度[7]。

總色差值ΔE計算公式如下所示：

1.6.7 數據統計

每組試驗重復3次，采用Origin9與SPSS19.0軟件對數據進行分析。

2 結果分析

2.1 不同保鮮劑處理對干豆腐感官評價的影響貯藏過程中干豆腐的感官評價結果見表2。

表2 貯藏過程中干豆腐的感官評價結果Table 2 Sensory evaluation results of dried tofu during storage

由表2可以看出，隨著貯藏時間的延長，干豆腐的感官品質隨之下降，感官評定值總體呈現下降趨勢。這可能是由于細菌的滋生、營養物質被分解以及產生各種異味物質而導致的。在表中可以看出，貯藏時間為2 d時，此時的對照組樣品已經呈現黃褐色，表面發黏，觸之即碎，產生酸味、餿味等不良氣味，此時的干豆腐已經失去食用價值；Nisin、納他霉素組樣品表面變為深黃色，干豆腐特有的香氣變平淡，口感變粗糙，彈性變差；而Nisin-納他霉素組樣品仍然呈現均勻淡黃色，口感細膩，形狀完整且具有獨特的清香氣味；貯藏時間為3 d時，Nisin和納他霉素處理組樣品表面均呈現黃褐色，發軟發黏，產生餿味，有破損的現象，說明此時的干豆腐已經失去食用價值，而Nisin-納他霉素處理組雖然表面變為深黃色，但依然保持組織狀態良好，有淡淡的干豆腐獨有的香氣，仍可繼續食用；貯藏時間為4 d時，此時的Nisin-納他霉素處理組也出現了淡淡的酸味及餿味，表面變為黃褐色，輕微發粘，部分表面變硬的情況，說明此時的干豆腐已經無法食用；貯藏時間為5 d時，樣品已徹底發黏，出現餿味酸味，表面變硬，徹底失去食用價值。由此可見，與對照組相比，Nisin-納他霉素處理后將產品的保質期提高了2倍，有效的延長了干豆腐的貨架期。

2.2 不同保鮮劑處理對干豆腐揮發性鹽基氮的影響

揮發性鹽基氮是指食品在貯存至腐敗過程中，由于霉菌和細菌的作用，使蛋白質分解而產生的氨以及胺類等堿性含氮物質[21]，這個指標通常被用來作為評判蛋白質產品的新鮮度，干豆腐在貯藏過程中TVBN值的變化見圖1。

由圖1可以看出，隨著貯藏時間的增長，4組樣品的TVB-N值均呈現上升趨勢，但Nisin-納他霉素組、Nisin、納他霉素組始終低于對照組的TVB-N值，且其中Nisin-納他霉素組的TVB-N始終最低。而非發酵豆制品揮發性鹽基氮衛生指標臨界值24 mg/100 g[4]。由此可見，與對照組相比，Nisin-納他霉素處理后有效的減少干豆腐在貯藏過程中的腐敗變質，將產品在37℃包裝條件下的保質期從1 d延長至3 d。

圖1 干豆腐在貯藏過程中TVB-N值的變化Fig.1 Changes of TVB-N value during storage of dried tofu

2.3 不同保鮮劑處理對干豆腐菌落總數的影響

干豆腐在貯藏過程中菌落總數的變化見圖2。

圖2 干豆腐在貯藏過程中菌落總數的變化Fig.2 Changes in the total number of colonies of dried tofu during storage

圖2所示，在貯藏過程中微生物不斷的生長繁殖，4組樣品中的菌落總數呈先上升后平緩的趨勢，其中Nisin-納他霉素組的菌落總數始終最低。國家非發酵性豆制品菌落總數衛生標準的臨界值為5.0 lgCFU/g[4]，貯藏2 d時的對照組已經超過國家標準臨界值；當貯藏3 d時，除Nisin-納他霉素處理組以外的Nisin處理組，納他霉素處理組及對照組都已超過國家衛生標準臨界值，失去食用價值；貯藏4 d時，復配處理組的菌落總數此時已經上升為5.05 lgCFU/g，也已超過了國家衛生標準臨界值。由此可見，從菌落總數來看，對照的保質期僅1 d，復合處理組可延長至3 d，說明Nisin-納他霉素復配保鮮劑能夠有效的抑制微生物的生長繁殖，使細菌細胞溶解，破壞細菌細胞質中的基質使其失去活性[22]，且二者共同使用具有協同作用，能更加高效地殺死干豆腐中的細菌微生物，提高食品品質，減少食品中營養破壞。因此，Nisin-納他霉素復配保鮮劑可有效減緩干豆腐的腐敗變質過程，并可延長其貨架期。

2.4 不同保鮮劑處理對干豆腐pH值的影響

干豆腐在貯藏過程中pH值的變化見圖3。

圖3 干豆腐在貯藏過程中pH值的變化Fig.3 Changes of pH of during storage dried tofu

由圖3所示，4組樣品的pH值隨著貯藏時間的延長均呈現先下降后上升的趨勢，在貯藏第3天時出現了轉折點。從圖中可以看到，在貯藏0～3 d時，處理組和對照組的pH值都呈下降趨勢，其中，對照組的pH值均最低處理組。豆制品的有效酸度為6.45[4]，顯然37℃條件下貯存2 d的對照組pH值已低于有效酸度值；而Nisin處理組和納他霉素處理組貯藏3 d時，pH值低于有效酸度值；在貯藏3 d～5 d時，處理組和對照組的pH值總體又均呈現上升趨勢，此期間對照組的pH值始終高于其它3個處理組，而其中Nisin-納他霉素處理組始終處于最低值。此時的pH值越大，表明食品的腐敗變質程度越大。由此可見，與對照組相比，Nisin-納他霉素處理后將產品的保質期提高了2倍。而pH值的變化趨勢為先下降后上升是因為微生物先利用豆腐中的碳水化合物產酸[23]，因此樣品pH值下降；然后再分解樣品中的蛋白質及一些含氮物質而產生堿性物質[24]，使其pH值又上升。Nisin-納他霉素復配保鮮劑在前期可以有效地抑制微生物的產酸過程，使其樣品pH值始終高于其他處理組，而在后期可以抑制蛋白質等含氮物質的分解，保證pH值始終為最低值。由此可見，Nisin-納他霉素復配保鮮劑對干豆腐具有高效的防腐保鮮效果。

2.5 不同保鮮劑處理對干豆腐揮發性氣味的影響

干豆腐在貯藏過程中的PCA分析見圖4，干豆腐在貯藏過程中LDA分析見圖5。

圖4 干豆腐在貯藏過程中的PCA分析Fig.4 PCA analysis of dried tofu during storage

圖5 干豆腐在貯藏過程中LDA分析Fig.5 LDA analysis of dried tofu during storage

由圖4和5可知，各組樣品分析數據點分布在各自區域，能明顯的被區分開。圖4 PCA分析數據圖可以看出，當處理第1天時，Nisin-納他霉素復配處理組、Nisin處理組及納他霉素處理組均分布在圖的左下側，對照組在圖的右下側，彼此之間距離較大。用LDA方法進行分析，如圖5所示，可以看出各處理組之間均可被明顯區分開來，新鮮組與處理組分布于圖兩側，且Nisin-納他霉素處理組距離新鮮組最近，對照組距離新鮮組最遠。用電子鼻檢測第2天的不同保鮮處理組的干豆腐，由PCA和LDA分析圖可得出與以上相同的結論。

當貯藏3 d時，干豆腐變得發黏，由圖4 PCA分析圖中可以看出，Nisin處理組和納他霉素處理組發生重疊，復配處理組距離新鮮組最近，而對照組距離新鮮組最遠；由圖5 LDA分析圖可知，復配處理組、Nisin處理組與納他霉素處理組均發生重疊，這可能是由于保鮮劑自身原因所導致的結果，由此可見，此時的干豆腐內部已經發生了腐敗變質，但復配保鮮組仍然最接近于新鮮組，這與以上的貯藏第3天是轉折點結論一致。當貯藏為第4天和第5天時，PCA和LDA分析圖得已無明顯規律，這可能是由于樣品品質變壞產生其他氣體所影響，說明此時的干豆腐已經失去食用價值。由此可見，電子鼻檢結果表明，從主成分分析（PCA）和線性判別式分析（LDA）中可以得到，電子鼻可以較好的評價貯藏過程中干豆腐的揮發性氣味的變化，并且可以明顯的區分出復配處理組、Nisin處理組、納他霉素處理組以及對照組。

2.6 不同保鮮劑處理對干豆腐色差的影響

色差值，一般用于評價顏色的差別。干豆腐在貯藏過程中其顏色、亮度、光澤等都會發生變化，但是一般情況下無法通過肉眼識別，因此利用色差計對干豆腐的顏色變化進行檢測[3]。總色差值ΔE可以用來表示顏色的變化。儲藏過程中干豆腐的色差變化見表3。

表3 儲藏過程中干豆腐的色差變化Table 3 Variation of color difference of dried tofu during storage

由表3可以看出，隨著貯藏時間的延長，處理組和對照組的ΔE值均發生變化，從數值上來看，各組干豆腐每天差異不大，沒有明顯的變化；但與同天對照組相比，保鮮劑保鮮程度排序為：Nisin與納他霉素復配保鮮劑＞Nisin＞納他霉素。

3 結論

干豆腐中營養豐富，富含大量蛋白質，但其極易發生腐敗變質，利用天然保鮮劑Nisin-納他霉素復配保鮮劑可以有效抑制腐敗菌的生長，延長干豆腐的貨架期。通過感官評定、揮發性鹽基氮、菌落總數、pH值、揮發性氣味及色差值對干豆腐的新鮮程度進行檢測，結果表明，干豆腐在37℃保存時，Nisin-納他霉素復配保鮮劑可有效抑制干豆腐的腐敗變質，將產品的保鮮期從1 d延長至3 d，有效的延長產品的貨架期。因此，Nisin-納他霉素復配保鮮劑可廣泛應用于食品行業中。此外，Nisin和納他霉素作為經濟實用型保鮮劑，既能節約成本又能高效保鮮，擁有廣闊的市場空間和良好的發展前景。