響應面法優(yōu)化玫瑰茄花青素提取工藝及穩(wěn)定性研究

（天津天獅學院，天津301700）

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.）是錦葵科木槿屬的一年生草本植物，是傳統(tǒng)藥食兩用植物。玫瑰茄原產于熱帶和亞熱帶，在福建、廣東、廣西、臺灣均有分布，云南臨滄元謀、永仁等地區(qū)已形成規(guī)模種植[1-2]。玫瑰茄花萼呈紫紅色，富含花青素、黃酮、多酚等生物活性成分，具有抗氧化、抗炎、降血壓、降血脂、降血糖[3-6]及抗腫瘤[7]等功效。玫瑰茄花含有蛋白質、維生素C、β-胡蘿卜素、鈣、鐵等營養(yǎng)物質，且具有顯著生理活性特性，目前主要用于花茶、果脯、蜜餞、果醬[2]、飲料、發(fā)酵乳等[8-9]食品的生產。研究表明，超聲波法可以縮短提取時間，增大花青素、黃酮類物質提取率[10-12]，優(yōu)化花色苷提取工藝。Hellstrom J等[13]研究指出，花色苷受自身化學結構、溫度、濃度、氧氣等內外因素的影響，高度不穩(wěn)定，容易降解。文獻指出溫度對龍葵果花色苷提取物有一定影響，隨著溫度升高，花色苷降解速率增大[14-15]。趙玉紅等[16]研究巴氏殺菌處理對龍葵果果汁特性的影響，指出果汁中多酚、花色苷、單寧含量隨著殺菌溫度的升高和殺菌時間的延長而降低。本試驗采用響應面試驗法優(yōu)化玫瑰茄花青素提取工藝，并分析花青素的熱穩(wěn)定性，為玫瑰茄資源的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

云南玫瑰茄：市售；無水乙醇（分析純）：天津江天化工技術有限公司；濃鹽酸、冰乙酸（分析純）：天津市大茂化學試劑廠；無水乙酸鈉、氯化鉀（分析純）：天津市福晨化學試劑廠。

1.2 儀器與設備

UV2550紫外分光光度計：島津儀器蘇州有限公司；ME204E分析天平、ME4002TE精密天平：梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司；SB-3200D超聲波清洗機：寧波新芝生物科技股份有限公司；TG18K高速離心機：長沙東旺實驗儀器有限公司；ZN-02型小型中藥粉碎機：中科耐馳技術（北京）有限公司；60目不銹鋼實驗室分樣篩：上海雷熙五金絲網制品有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 玫瑰茄花青素的提取工藝

用ZN-02型中藥粉碎機將玫瑰茄原料粉碎，過60目篩，放入棕色試劑瓶中密封保存。稱取經過預處理的玫瑰茄樣品粉，按照一定的料液比加入乙醇溶液，進行超聲波輔助提取。將玫瑰茄提取液冷卻、離心后制得上清液，采用pH示差法測定玫瑰茄花青素得率[14，17]。分別移取配制好的玫瑰茄提取液1.0mL，用pH=1.0、pH=4.5的緩沖液稀釋至10 mL比色管中，平衡穩(wěn)定60 min后在波長520 nm和700 nm處測定吸光度，按照公式1計算花青素得率。

式中：A為（A520nmpH1.0-A700nmpH1.0）-（A520nmpH4.5-A700nmpH4.5）；ε為摩爾消光系數(shù)，26 900 L/（mol·cm）；L為光程，1 cm；M為-矢車菊活化素-3-葡萄糖苷的分子量，449.2；DF 為稀釋因子；V 為提取液體積，mL；W 樣品質量，g。

1.3.2 玫瑰茄花青素提取單因素試驗

準確稱取經預處理的玫瑰花樣品1 g，置于250 mL磨口三角瓶中，在提取溫度50℃條件進行超聲功率、提取時間、乙醇濃度、料液比的花青素提取單因素試驗，確定各因素的優(yōu)水平。

1.3.3 玫瑰茄花青素提取響應面試驗

基于玫瑰茄花青素單因素試驗的結果，應用Design-Expert10軟件對提取時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比做響應面試驗設計，其試驗因素水平編碼表詳見表1。

表1 花青素響應面試驗編碼水平表Table 1 Factors and levels in Box－Benhnken design of anthocyanin

1.3.4 玫瑰茄花青素穩(wěn)定性分析

1.3.4.1 溫度對花青素穩(wěn)定性影響

按照試驗方法1.3.1提取玫瑰茄花青素，配制成稀釋5倍、10倍、15倍花青素稀釋液。吸取2 mL花青素稀釋提取液于 25 mL 比色管中，在 65、70、75、80、85、90 ℃的水浴鍋中分別熱處理 30、60、90、120 min，放入冷水中快速冷卻，按照方法1.3.1測定熱處理后花青素濃度，計算花青素保留率[14]。

1.3.4.2 pH值對花青素穩(wěn)定性影響

按照1.3.4.1中制備稀釋5倍花青素稀釋液，用1 moL/L 鹽酸溶液調 pH 值為 3、4、5、6、7 5種花青素樣品溶液[18]。在溫度90℃條件下熱處理120min，按1.3.4.1方式計算花青素保留率，分析pH值對玫瑰茄花青素的穩(wěn)定性影響。

2 結果與分析

2.1 玫瑰茄花青素提取單因素試驗

2.1.1 超聲波功率對花青素提取效果的影響

在提取時間30 min、乙醇濃度 70%、料液比1∶20（g/mL）條件下，溫度設定為50℃，考察超聲功率對玫瑰茄花青素得率的影響，結果見圖1。

圖1 超聲功率對花青素得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on the yield of anthocyanin

由圖1可知，超聲功率增加到144 W時玫瑰茄花青素得率為3.68 mg/g。超聲功率低于或高于144 W，玫瑰茄花青素得率呈現(xiàn)不同程度的降低，可能是由于一定功率的超聲波可以促進花青素的溶出，但功率過大可能會破壞花青素的結構，確定超聲波功率144 W為花青素提取的較優(yōu)水平。

2.1.2 料液比對花青素得率的影響

在超聲功率144 W、提取時間30 min、乙醇濃度70%條件下，超聲溫度50℃，分析料液比對玫瑰茄花青素得率的影響，結果見圖2。

圖2 料液比對花青素得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of anthocyanin

由圖2可知，玫瑰茄花青素得率隨溶劑體積的增加而出現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢，在料液比1∶30（g/mL）時花青素得率較高為3.80 mg/g。可能是由于提取溶劑增大有利于花青素物質溶出，但料液比增加至1∶30（g/mL）后玫瑰茄花青素基本都溶出，繼續(xù)增大料液比效果不明顯，確定料液比1∶30（g/mL）為較優(yōu)水平。

2.1.3 超聲時間對花青素得率的影響

在超聲功率 144 W、料液比 1∶30（g/mL）、乙醇濃度70%、超聲溫度50℃條件下，分析提取時間對玫瑰茄花青素得率的影響，結果見圖3。

圖3 提取時間對花青素得率的影響Fig.3 Effect of exaction time on the yield of anthocyanin

提取時間30 min玫瑰茄花青素得率最高為3.42（mg/g），隨提取時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象，可能提取時間延長使部分花青素被氧化，導致花青素得率降低，選擇提取時間30 min為較優(yōu)水平。

2.1.4 乙醇濃度對花青素得率的影響

在超聲功率 144 W、料液比 1 ∶30（g/mL）、提取時間30 min、提取溫度50℃的條件下，分析提取溶劑乙醇濃度對玫瑰茄花青素得率的影響，結果見圖4。

圖4 乙醇濃度對玫瑰茄花青素得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由圖4可知，花青素得率隨著乙醇濃度的升高呈現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，乙醇濃度70%得率最大為3.63 mg/g。可能是由于一些醇溶性雜質、親脂性強的成分與乙醇、水分子結合，導致花青素得率下降，故確定乙醇濃度為70%為較優(yōu)水平。

2.2 響應面優(yōu)化玫瑰茄花青素提取條件

2.2.1 玫瑰茄花青素響應面提取試驗結果

在分析玫瑰茄花青素提取的單因素試驗結果基礎上，應用Design Expert 10進行響應面試驗，分析提取時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比對玫瑰茄花青素得率的影響，響應面試驗結果詳見表2。

表2 響應面試驗方案及結果Table 2 Results of Box-Benhnken design

續(xù)表2 響應面試驗方案及結果Continue table 2 Results of Box-Benhnken design

2.2.2 響應面試驗結果方差分析

對表2玫瑰茄花青素響應面試驗結果進行方差分析，各差異源對花青素得率的影響分析詳見表3。

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 ANOVA for Box-Benhnken design

由表3可知，C、BC、D2對花青素提取得率的影響顯著，B、AD、A2、B2、C2對提取效果的影響非常顯著。通過比較差異源F值的大小，提取時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比在所設定的范圍內對玫瑰茄花青素提取得率的影響程度依次為B＞C＞D＞A。

應用Design-Expert10軟件對提取時間、超聲功率、乙醇濃度、料液比4個因素進行回歸擬合分析，建立多元回歸模型：R1=-25.022 8+0.174 9A+0.164 4B+0.269 8C+0.357 6D-1.490 0×10-3A2-9.722 2×10-5AB-1.250 0×10-4AC-2.100 0×10-3AD-6.257 7×10-4B2+4.722 2×10-4BC-6.111 1×10-4BD-2.227 5×10-3C2-9.000 0×10-4CD-2.260 0×10-3D2。多元回歸模型統(tǒng)計量 P＜0.000 1＜0.01，失擬項 P=0.187 3＞0.05，決定系數(shù) R2=0.927 4，表明回歸方程顯著、失擬項不顯著，響應面回歸方程的擬合程度良好。

2.2.3 響應面圖分析

應用Design-Expert10對表3數(shù)據(jù)進行分析，繪制出響應曲面圖5～圖10。

圖5 提取時間與超聲功率對花青素得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time and ultrasonic wave power on the yield of anthocyanin

圖6 提取時間與乙醇濃度對花青素得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic time and ethanol concentration on the yield of anthocyanin

由響應面回歸方程及響應曲面圖可知，因素BC、CD的交互作用明顯。采用軟件優(yōu)化分析得出最佳提取條件為提取時間27.1 min、超聲功率137.9 W、乙醇濃度 67.5%、料液比 1∶34.4（g/mL）。

圖7 提取時間與料液比對花青素得率的影響Fig.7 Effect of ultrasonic time and liquid ratio on the yield of anthocyanin

圖8 超聲功率與乙醇濃度對花青素得率的影響Fig.8 Effect of ultrasonic wave power and ethanol concentration on the yield of anthocyanin

圖9 超聲功率與料液比對花青素得率影響Fig.9 Effect of ultrasonic wave power and liquid ratio on the yield of anthocyanin

為了便于控制玫瑰茄花青素超聲提取條件，提取參數(shù)設置為時間27 min、超聲功率138 W、乙醇濃度68%、料液比 1∶34（g/mL），其預測值為3.94 mg/g。以所得優(yōu)化條件進行3次平行驗證試驗，玫瑰茄花青素得率為（3.93±0.04）mg/g，與模擬預測值接近，表明預測值與試驗值有較好的擬合度，多元回歸方程可靠。

2.3 玫瑰茄花青素穩(wěn)定性分析

2.3.1 溫度對花青素穩(wěn)定性影響

圖10 乙醇濃度與料液比對花青素得率影響Fig.10 Effect of ethanol concentration and liquid ratio on the yield of anthocyanin

依據(jù)試驗方法1.3.1制備玫瑰茄花青素提取液，測定花青素濃度為128.25 μg/mL，配制成稀釋度5倍、10倍、15倍玫瑰茄花青素樣液。對不同稀釋倍數(shù)的花青素提取液分別熱處理30、60、90、120 min，計算花青素保留率，如圖11～圖13所示。

圖11 稀釋5倍花青素熱穩(wěn)定性分析Fig.11 Analysis on stability of anthocyanin diluted 5 times

圖12 稀釋10倍花青素穩(wěn)定性分析Fig.12 Analysis on stability of anthocyanin diluted 10 times

圖13 稀釋15倍花青素穩(wěn)定性分析Fig.13 Analysis on stability of anthocyanin diluted 15 times

同樣熱處理條件下，稀釋倍數(shù)越大、熱處理溫度越高花青素穩(wěn)定性越差，玫瑰茄花青素在90℃、120 min條件下減少量最大為42.05%。稀釋倍數(shù)增大增強花青素分散性，熱處理溫度增高促使酚羥基不穩(wěn)定，使花青素易氧化，故保留率降低。

2.3.2 pH值對花青素穩(wěn)定性影響

在分析溫度對花青素穩(wěn)定性分析基礎上，計算在90℃條件下熱處理溫度時間120 min后，不同pH值花青素提取液的穩(wěn)定性，如圖14所示。

圖14 pH值對花青素穩(wěn)定性影響Fig.14 Influence of pH on stability of anthocyanin

pH 3～4玫瑰茄花青素保留率變化較大，pH 5～7保留率變化較小，說明在pH值在3～7范圍內，pH值越大花青素穩(wěn)定性越差。

3 結論

以云南產玫瑰茄為原料，在分析超聲功率、提取時間、料液比、乙醇濃度單因素試驗的基礎上，應用Design-Expert10進行玫瑰茄花青素提取響應面優(yōu)化試驗，得到最佳提取條件為時間27 min、超聲功率138 W、乙醇濃度 68%、料液比 1∶34（g/mL），花青素得率為（3.93±0.04）（mg/g），與模擬預測值接近。玫瑰茄花青素提取液稀釋倍數(shù)越大、熱處理溫度越高花青素穩(wěn)定性越差，玫瑰茄花青素在90℃、120 min條件下減少量最大為42.05%。隨著pH值增大花青素穩(wěn)定性降低。