苦瓜皂甙的提取及其對胰脂肪酶抑制活性的研究

周巧杰，吳子健，*，胡佩卿，侯惠靜

（1.天津商業大學生物技術與食品科學學院，天津市食品生物技術重點實驗室，天津300134；2.廣東寶萊特醫用科技股份有限公司，天津300134；3.天津天獅學院 食品工程學院，天津301700）

目前常用的減肥藥是通過影響中樞神經系統來抑制人體的食欲，但會對神經系統造成傷害[1-3]，而植物源的皂甙、多酚以及三萜類化合物會通過降低甚至是抑制脂肪酶的活力[4-5]，使得脂肪在進入機體后無法得到有效的分解，脂肪在胃腸道內無法得到吸收，是目前比較有效的一種減肥的手段[6-8]，諸如：2006年Kimura H等發現七葉樹種子皂苷混合物可強烈抑制胰脂肪酶的活性[9]；2008年Hu J等的研究進一步證明七葉樹種子的總皂甙混合物能有效降低機體對于脂肪的吸收，從而抑制喂食高脂肪食物小鼠的體重、機體脂肪含量以及肝臟脂肪含量的增加[10-11]；Zheng Q等發現從絲石竹根部提取出的皂甙混合物能有效抑制了胰脂肪酶活性，絲石竹根部皂甙混合物對于脂肪酶IC50值為0.54 mg/mL[12]；Karu N等發現源自人參根的人參皂甙能有效控制高脂飲食條件下，進食小鼠的體重，小鼠機體血漿中的三酰甘油量低于預期值，其對于胰脂肪酶的 IC50值為 500 μg/mL[13]。

苦瓜（Momordica charantia）是一種藥食同源的葫蘆科植物食材，性苦味寒，是中國家庭常用蔬菜之一。其含有豐富的皂甙類物質，主要由皂甙元和糖、糖醛酸組成，苦瓜皂甙（Momordica saponins）不僅具有降血糖、抗氧化、提高免疫能力、降低膽固醇、抗艾滋病毒等生理功能，也具有較強的抑制脂肪酶酶活性的作用[14-15]，其可能會成為減肥的輔助食物補充劑。本研究目的是優化乙醇溶劑法提取苦瓜皂甙的工藝條件，并對苦瓜皂甙對胰脂肪酶的抑制性做出相應分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦瓜粉：朝陽大地農產品加工有限公司；豬源胰脂肪酶、人參皂苷Rg1標準品：Sigma公司；橄欖油：中國糧油食品進出口有限公司。其余試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

3-18K臺式高速冷凍離心機：德國SIGMA公司；R-200旋轉蒸發儀：日本EYELA公司；NTS-4000C型恒溫振蕩水槽：東京理化器械株式會社；FW80微型高速萬能粉碎機：天津市華鑫儀器廠；ZHWY-2102C新型恒溫震蕩器：上海智成分析儀器制造有限公司；AL204型電子天平、UV5紫外可見分光光度計：梅特勒－托利多儀器上海有限公司；FDU-810型冷凍干燥機：日本東京理化。

1.3 方法

1.3.1 苦瓜皂甙提取的基本工藝路線

苦瓜粉→正己烷脫脂→乙醇浸提（合并浸提液）→離心→過濾→得皂甙粗液→旋轉蒸發得濃縮液→測定濃度→真空冷凍干燥→皂甙粉→測定胰脂肪酶活力抑制率[16-17]

1.3.2 苦瓜粉脫脂處理

苦瓜粉脫脂采用正己烷脫脂法[18]，具體步驟如下：干燥的苦瓜粉碎過24目篩，收集粉末；取20 g篩分的粉末，按苦瓜粉 ∶正己烷=1.0∶2.5（g/mL）混勻，并于4℃下磁力攪拌30 min進行脫脂；然后4℃下離心（4 000 g）10 min，棄上清，并重復上述3次操作，最后沉淀物（即脫脂后的苦瓜粉）干燥備用。

1.3.3 響應面法優化苦瓜皂甙提取條件

為確定苦瓜皂甙的提取最佳提取條件，以提取物產量為響應值，采用三步法進行優化。第一步采用五因素二水平部分因子試驗設計，挑選出顯著影響因素；第二歩通過最陡爬坡試驗確定響應值最大時的中心試驗點；第三步利用響應曲面法中的中心復合設計進行試驗，通過試驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優的苦瓜皂甙提取條件，并進行驗證。響應面試驗設計因素與水平表見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平表Table 1 Response surface test design factors and level table

1.3.4 苦瓜皂甙提取產率的測定與計算

苦瓜皂甙含量的測定利用分光光度法[19]進行：以人參皂苷Rg1作為標準物質，在550 nm處測定吸光度，最后依據回歸方程，計算樣品中苦瓜皂甙的含量。苦瓜皂甙的提取產率按下式計算：

式中：m1為樣品溶液中苦瓜皂甙的質量，mg；m2為脫脂苦瓜干粉的質量，mg。

1.3.5 胰脂肪酶抑制率的測定

在50 mL的三角燒瓶中加入15 mL反應介質（150 mmol/L NaCl2、2 mmol/L Tris、10 mmol/L CaCl2，0.08 mg/L豬膽鹽）和0.5 g底物乳液（4%聚乙烯醇與三丁酸甘油酯以3∶1混合，高速攪拌均勻，得乳白色）[20]，機械攪拌5 min后加入一定量的豬胰脂肪酶混勻，反應3 min后，加入15 mL 95%的乙醇滅活胰脂肪酶。在反應完的體系中加入酚紅－麝香草酚藍指示劑1滴～2滴，用0.1 mol/L的NaOH溶液滴定，使反應液的pH值恒定在7.5，記錄消耗NaOH滴定液的體積A（mL）。空白試驗在加入15 mL乙醇之后再加入脂肪酶，記錄消耗NaOH滴定液的體積B（mL）。按下式計算脂肪酶活力：

式中：A為平行試驗組消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積，mL；B為空白試驗消耗氫氧化鈉滴定液的體積，mL；M為氫氧化鈉滴定液的摩爾濃度，mol/L；W為脂肪酶的取樣量，g；T為反應時間，min；

胰脂肪酶活力單位定義：在37℃，pH值為7.5的條件下，脂肪酶每分鐘水解三丁酸甘油脂生成1 μmoL脂肪酸所需的酶量，為1活力單位。

對于胰脂肪酶的抑制率的計算按照公式（3）進行計算。

1.3.6 苦瓜皂甙對胰脂肪酶抑制率的測定

將苦瓜皂甙浸提物配制成濃度分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 mg/mL 不同溶液，參考 1.3.5胰脂肪酶抑制率的測定方法，測定各種濃度苦瓜粉浸提物對胰脂肪酶活性的抑制率。

2 結果與分析

2.1 部分因子試驗結果及回歸分析

部分因子試驗結果見表2。

表2 部分因子試驗結果Table 2 Experimental results of some factors

部分因子試驗結果回歸分析見表3。

表3部分因子試驗結果的回歸表明：溫度、時間和料液比3個預測變量P值均小于0.05，因此它們是苦瓜皂甙提取過程中顯著性影響因子。

2.2 中心試驗點的確定結果

在確定了苦瓜皂甙浸提過程中顯著性影響因子后，針對浸提溫度、時間和料液比進行最陡爬坡試驗，顯著因素的方向、步長和試驗結果如表4所示。

表3 部分因子試驗結果回歸分析Table 3 Regression analysis of partial factor experimental results

表4 最陡爬坡試驗及結果Table 4 Experiment and results of the steepest climb

從表4中可以看出在溫度為40℃、時間為75 min、料液比1∶13（g/mL）時苦瓜皂甙的產率達到最大值，確定該組合為響應面試驗設計的中心點。

2.3 最佳浸提條件的確定結果

2.3.1 響應面試驗設計及結果

選取浸提次數在較低水平，即1次，乙醇濃度在較高水平，即50%，進行三因素三水平中心組合試驗。試驗的設計及響應結果如表5所示。

表5 中心復合試驗結果Table 5 Results of central composite experiment

續表5 中心復合試驗結果Continue table 5 Results of central composite experiment

用Design Expert 8.0.6響應面分析軟件進行多元回歸分析，對各因素進行回歸擬合，得到二次回歸方程式：

Y=-17.17030+0.099881X4+0.087809X3+1.97715X5-0.000 1X3X4-0.004 595X4X5+0.003 959X3X5-0.000 395 9 X4X4-0.000 945 9X3X3-0.080 13X5X5

決定系數R2=0.926 4，說明回歸方程擬合較好。

。按照實際需求，D大多處于30～60 s范圍內；而發車間隔H在高峰段約為120～300 s，在低峰段約為180～600 s。由此可確定基因的長度，并相應隨機選擇50個個體組成種群。

2.3.2 回歸分析模型及方差分析

回歸分析模型及方差分析結果見表6。

表6 回歸分析模型及方差分析結果Table 6 Box-behken experiment and results

從表6中可以看到，回歸模型的顯著性檢驗P＜0.05，表明該模型具有統計學意義。此外失擬項P值為0.113 8＞0.05不顯著，進一步說明模型擬合程度較好，用上述回歸方程可很好地描述各因子與響應值之間的關系，因此可用該回歸方程對苦瓜皂甙的提取產率進行預測和分析。同時其自變量一次項X3，X5，二次項X32，X42，X52，交互項 X3X5，X4X5均顯著（P＜0.05），說明它們對苦瓜皂甙的提取產率有顯著影響。

2.3.3 響應面分析與最優條件確定

響應面分析方法中的等高線圖可以直觀反映兩因素交互作用的顯著程度，橢圓形表明兩因子相互作用顯著，而圓形恰好相反，表明不顯著[21-22]。各因素交互作用對皂苷提取率的曲面圖和等高線圖見圖1。

圖1 各因素交互作用對皂苷提取率的曲面圖和等高線圖Fig.1 Curve diagram and contour diagram of extraction rate of saponin by interaction of various factors

由圖1 a的曲面圖可以看出當溫度不變時，苦瓜皂甙的提取產率隨著時間的增大呈現降低的趨勢，而當時間不變時，苦瓜皂甙的提取產率對溫度差異不敏感，沒有明顯變化。由等高線可知，提取時間比溫度對皂甙提取產率影響大，與方差分析一致。當溫度在33℃～48℃，時間在72 min～80 min時，有利于苦瓜皂甙的提取。

由圖1 b可以看出當溫度和料液比分別不變時，伴隨著溫度和料液比的增大，苦瓜皂甙的提取率呈現下降的趨勢。由等高線可知，與溫度相比，苦瓜皂甙的提取率受料液比的影響較大，與方差分析一致。當溫度在33℃～47℃，料液比在1∶12.8（g/mL）～1∶13.75（g/mL）時，有利于苦瓜皂甙的提取。

采用Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程進行分析，得到提取苦瓜皂甙的最佳工藝條件為：乙醇濃度為50%，料液比為 1∶13.5（g/mL），浸提溫度為38.34℃，浸提時間為77.11 min，浸提次數為1次時，提取產率為1.428 4%。

2.4 最佳浸提條件試驗結果

利用上述響應面法試驗得到的苦瓜皂甙的提取條件，進行3次提取試驗（平行試驗），結果見表7。

表7 驗證與比較試驗結果Table 7 Verification and comparison of experimental results

由表7結果可知，最終皂甙產率達1.419 1%，與數學模型預測的最大產率符合，說明50%乙醇、料液比 1∶13.5（g/mL），溫度 38℃，浸提 77min，浸提 1次是苦瓜皂甙提取的最優條件。

2.5 不同濃度的苦瓜皂甙對胰脂肪酶抑制率的分析結果

苦瓜皂甙濃度對其脂肪酶抑制率的影響見圖2。

圖2 苦瓜皂甙濃度對其脂肪酶抑制率的影響Fig.2 Effect of concentration of Momordica saponins on inhibition rate

從圖2可以看出：當苦瓜皂甙的濃度在0～8mg范圍內，抑制率隨著濃度的增大而增大，即提高對于胰脂肪酶活性的抑制程度；當濃度在8 mg～10 mg范圍內，隨著濃度的增大，抑制率的提高逐漸趨于平緩，由圖2可以計算出IC50為0.384 7 mg/mL。

3 結論

苦瓜皂甙最佳浸提條件為：浸提時間77 min、乙醇濃度 50%、浸提溫度 38℃，料液比 1∶13.5（g/mL），浸提次數1次；此條件下苦瓜皂甙產率達到1.419 1%；所得苦瓜皂甙對胰脂肪酶的IC50值為0.384 7 mg/mL。