梯棱羊肚菌富硒條件優化工藝研究

趙航軻，黃國明，2，彭浩，2，*

（1.陜西理工大學生物科學與工程學院，陜西漢中723000；2.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西漢中723000）

梯棱羊肚菌是一類世界分布的名貴食藥用真菌，味道鮮美、營養豐富，與松茸、黑松露、牛肝菌被譽為“四大珍稀食用菌”，具有很高的營養和藥用價值[1-5]。梯棱羊肚菌是以人工栽培的極少數羊肚菌種類之一[6]，由于基礎研究薄弱影響了其穩產和高產，若前期的菌種具有活性高、成活率高適應力強等特點，則為羊肚菌的馴化栽培提供了最有利條件[7]。故采用羊肚菌液體培養的方式，這種方式可解決食用菌對環境的依賴同時有效地提高產量。羊肚菌液體種與栽培種在生理功能與化學組成上相差不大，并且生長速度快、高校經濟是一種適合工業化生產的培養方式。因此，現在培養羊肚菌的主要方法是液體培養法。

硒是人體必需的15種微量營養元素之一，有機硒更易被人體而吸收，其吸收率可達70%以上。硒可以保護細胞及組織免受過氧化物損傷，維持細胞正常功能[8]。在醫學上硒可以抗氧化、清除自由基、降低血液黏度[9-10]。從我國的地理分布來看在浙江龍游、陜西南部、新疆天山北坡、江西豐城等地有較高硒含量，其他地區硒含量匱乏，所以富硒食品的開發有很重要的意義[11]。

食用菌因具有較強的富硒能力，是一個很好的富硒載體，可以使無機硒安全有效地轉化為有機硒，同時食用菌的營養成分因富硒得到改善[12]。羊肚菌對硒具有較強的富集和轉化作用，且硒多糖具有較強的抗氧化能力[13-14]，硒化修飾的羊肚菌蛋白的總抗氧化活性是羊肚菌蛋白的1.33倍，對ABTS自由基、羥基自由基和H2O2的清除活性分別比羊肚菌蛋白提高了71.62%，11.11%和18.26%[15]。本研究通過單因素及正交試驗對羊肚菌最佳富硒濃度及富硒條件進行研究，為富硒羊肚菌液體菌種制備及羊肚菌富硒液體深層發酵提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：梯棱羊肚菌（Morchella sextelata），由陜西省食藥用菌工程技術研究中心提供。

基礎培養基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂18g、KH2PO42g10mg、自來水 1000mL，pH 值自然。

葡萄糖（純度99%）、磷酸二氫鉀（分析純）、鄰苯二胺（分析純、）乙二胺四乙酸（分析純）、亞硒酸鹽（純度99%）：天津市盛奧化學試劑有限公司；瓊脂（純度96%）：北京奧博星生物技術責任有限公司純度99%）：華中藥業股份有限公司；甲苯（分析純）、濃硝酸（分析純）：天津市登豐化學品有限公司；濃硫酸（分析純）：成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器設備

SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；TB-214電子分析天平：北京賽得利斯儀器系統有限公司；LRH-250-GS生化培養箱：廣東省醫療器械廠；LS-B50L高壓蒸汽滅菌鍋、DHG-B50L電熱恒溫鼓風干燥箱：上海醫用核子儀器廠；優普UPR系列純水系統：西安優普儀器設備有限公司；ZWY-2112B恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；UV2600紫外分光光度器：上海精密科學儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津騰試驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種活化

在試驗前將保藏的菌株刮取0.5 cm×0.5 cm接種至平板培養基，放入恒溫培養箱中，25℃培養24 h進行活化。

1.3.2 液體富硒條件單素優化

富硒范圍篩選：精確稱取亞硒酸鈉0.547 6 g純水定容至250 mL，此時溶液的硒濃度為1.000 0 g/L，按梯度稀釋。設置硒濃度梯度為 0.00、10.00、20.00、30.00、40.00、50.00、60.00、70.00、80.00、90.00、100.00 mg/L。根據羊肚菌的菌絲體生物量及富硒率篩選出羊肚菌的硒生長范圍。

裝液量的篩選：在最適亞硒酸鈉添加量的情況下，250 mL 三角瓶設置裝液量為 75、100、125、150、175 mL，根據富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳裝液量。

初始pH值篩選：在最優條件下，對羊肚菌富硒液體培養基的初始pH值（用0.1 moL/L的NaOH和0.1 moL/L的HCl調節）篩選，設置初始pH值梯度為5、6、7、8、9，根據富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳初始pH值。

發酵時間篩選：在最優條件下，設置發酵時間分別為 3、4、5、6、7、8 d，根據富硒菌絲生物量與富硒率確定最佳培養時間。

1.3.3 液體富硒條件正交優化

在單因素試驗的基礎上，進行L9（34）的正交分析試驗，以確定各因素對羊肚菌菌絲生物量及富硒率的影響，確定其條件的最佳組合。正交因素及水平見表1。

表1 正交因素及水平Table 1 Factors and levels

1.3.4 硒含量的測定

硒母液配制：精確稱取亞硒酸鈉0.219 0 g，先用10mL鹽酸溶液（HCl∶H2O=1∶1，體積比）潤濕，放入水浴鍋55℃加熱促溶，冷卻后用稀硝酸（HNO3∶H2O=1∶9，體積比）定容至100 mL，此時得到1 g/L的硒溶液。將其液稀釋100倍得到10 μg/mL的硒溶液，配置濃度為0.00、5.00、10.00、15.00、20.00、25.00、30.00、35.00 μg/mL的硒標準溶液，各取1 mL加水至40.0 mL，再分別加入2.0 mL 5%乙二胺四乙酸和2.0 mL 1%鄰苯二胺，用50%HCl調節溶液pH值至2.0，混勻后20℃避光60 min，加入10.0 mL甲苯，超聲4 min后靜置10 min。在335 nm波長下測定各標準溶液的吸光度。以吸光度為橫坐標，硒含量為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.5 樣品硒含量的測定

硒含量測定原理：鄰苯二胺法[16-17]，精確稱取樣品0.3 g，研磨后放入三角瓶中，用10.0 mL濃硫酸潤濕樣品，加入20.0 mL濃硝酸-高氯酸（2∶1，體積比）混合酸，消化過夜。用水浴加熱至溶液漸漸變為棕黃色，白煙除盡為止，加入10.0 mL的稀鹽酸（濃鹽酸∶蒸餾水=1∶9，體積比），繼續加熱至溶液不變色，即達到消化終點。取10.0 mL消化液，加純水30.0 mL，再加入5%乙二胺四乙酸2.0 mL和1%鄰苯二胺2.0 mL，因用強酸消化故pH值不用調節，混勻后20℃避光放置60 min，加入10.0 mL甲苯，超聲4 min，移入分液漏斗中靜置10 min[18]。在335 nm波長下測定試液的吸光度，以空白樣做對比，測定試液的吸光度，對比標準曲線求出硒濃度，富硒率計算公式如下所示。

F/%=（Wi-W0）×Mi/Wj×100

式中：F為富硒率，%；Wi為富硒菌絲體硒含量，mg/g；W0為空白（不添加硒）菌絲體硒含量，mg/g；Wj為培養基內添加的初始硒量，mg；Mi為富硒菌絲體干重，g。

2 結果與分析

2.1 硒含量標準曲線

硒標準工作曲線如圖1所示。菌株的硒含量可從標準曲線上查出或者通過線性回歸方程y=182.99x-22.872（R2=0.998 6）。

圖1 硒含量標準曲線Fig.1 Standard curve of selenium content

2.2 羊肚菌耐硒范圍及富硒率結果

最適富硒范圍及最佳富硒率篩選結果見表2和圖2。

表2 耐硒范圍及富硒率結果Table 2 Results of selenium tolerance range and selenium enrichment rate

圖2 富硒生物量及富硒率結果Fig.2 Results of Selenium-rich biomass and selenium enrichment rate

由表2和圖2可看出硒添加量在0～100 mg/L范圍內羊肚菌菌絲均能生長，當硒添加量在0～20 mg/L范圍內菌絲生物量較高且相對穩定，當硒添加量超過20 mg/L時，菌絲生物量逐漸減少。富硒率在0～5 mg/L時較少，在10 mg/L～20 mg/L逐漸增加，大于20 mg/L時逐漸減少并且不穩定。綜合考量，生物量和富硒率考慮選擇添加量為20 mg/L。

2.3 裝液量篩選結果

最佳裝液量篩選結果見表3。

表3 裝液量篩選結果Table 3 Filling volume screening results

由表3可以看出在75 mL～150 mL范圍內隨著裝液量的增加菌絲生物量逐漸增加，在150 mL～175 mL范圍內隨著裝液量的增加菌絲生物量逐漸減小。當裝液量為125 mL時，菌絲生物量與富硒率達到最佳，初步篩選出最佳裝液量為125 mL。

2.4 初始pH值篩選結果

初始pH篩選結果見表4。

表4 pH值篩選結果Table 4 pH value filter result

由表4可知，當pH值為5～6時，菌絲生物量、硒含量及富硒率逐漸增加，且當pH值為6時，菌絲生物量達到最大（11.072 g/L），富硒率達到最高（31.30%），硒含量較高（0.804 2 mg/g）。當pH值在7～9范圍內菌絲生物量、硒含量及富硒率均呈下降趨勢，所以初步篩選出pH值為6。

2.5 發酵時間篩選結果

發酵時間篩選結果見表5。

表5 發酵時間篩選結果Table 5 Filling volume screening results

由表5可以看出隨著發酵時間的延長，菌絲在3 d～6 d生長速度較快富硒率快速升高，在6 d以后生長速度較慢且富硒率逐漸降低。故發酵時間選6 d較好。

2.6 富硒條件正交試驗結果

正交試驗結果見表6。

表6 正交試驗結果Table 6 Orthogonal experimental result

正交試驗結果如表6所示，由極差|R|值可知硒濃度、裝液量、發酵時間及pH值4個因素對富硒率影響的大小順序為A＞D＞C＞B，即硒濃度＞pH值＞發酵時間＞裝液量，正交試驗表明能夠使富硒率達到最大值的最佳組合是A2B2C1D1。

根據正交試驗結果進行方差分析見表7。

表7 方差分析結果Table 7 Results of variance analysis

如表7所示，4個影響因素中硒濃度達到極顯著水平，發酵時間和pH值達到顯著水，裝液量影響不顯著，即對富硒率影響的大小順序為A＞D＞C＞B，其中硒濃度影響最大，與極差結果基本一致。因此確定羊肚菌最佳液體富硒條件為：硒濃度20 mg/L、裝液量125 mL、發酵時間6 d、pH值為6。

驗證試驗：用正交試驗得出的最佳液體培養條件A2B2C1D1進行驗證試驗，設置5組平行試驗，得出羊肚菌菌絲生物量達到11.304 g/L，有機硒含量為0.683 mg/g，富硒率為37.15%，因此本試驗所得的羊肚菌最佳液體富硒條件真實可靠。張躍飛[19]在富硒羊肚菌的工藝優化中得到亞硒酸鈉的添加量為9 mg/L，裝液量為100 mL/250 mL，pH值7.0，富硒率為18.34%。冮潔等[20]在羊肚菌菌絲體富硒過程中得到的最適培養條件為：亞硒酸鈉質量濃度為10 mg/L，裝液量100 mL/250 mL，溫度25℃，裝液初始pH值7，富硒率最大達9.10%。丁健峰[21]在羊肚菌富硒深層發酵工藝及產物功能性研究中硒添加量為86.67 mg/L，培養溫度25.73℃，菌絲生物量的達到10.339 g/L、富硒率達到18.6%。本試驗在羊肚菌較高生物量的同時也保持高富硒率，與上述文獻報道相比都有顯著提高，在生產實踐中具有一定的參考價值。

3 結論

本試驗通過單因素試驗和正交試驗確定梯棱羊肚菌最佳液體富硒養條件為：硒濃度20 mg/L、裝液量125 mL/250 mL、發酵時間6 d、pH值為6，在此條件下羊肚菌菌絲生物量達到11.304 g/L，有機硒含量為0.683 mg/g，富硒率為37.15%。

本試驗中無機硒的添加對羊肚菌的生長在高濃度條件下具有抑制作用，但在較低濃度下生物量及富硒率不斷增加。表明向羊肚菌液體培養基中添加無機硒來提高富硒率是有效可行的。為了進一步提高富硒率，可以進從分子角度進一步對羊肚菌富硒機理進行研究，提高硒的轉化效率。富硒羊肚菌的研發具有一定的藥理保健功效，使富硒羊肚菌在食品及保健品方面具有廣闊的發展及應用前景。