響應面法優化超聲波輔助提取山竹果皮多糖的工藝及其體外抗氧活性研究

李珊，梁儉，馮彬，劉曉鳳，冼麗清

（1.桂西區域生態環境分析和污染控制重點實驗室，百色學院化學與環境工程學院，廣西百色533000；2.百色學院材料科學與工程學院，廣西百色533000）

山竹，著名的熱帶水果，以其果肉潔白豐腴、質軟味甜、營養全面且豐富而受到廣大消費者的喜愛，被譽為“水果皇后”[1]。山竹在我國南方有少量種植，產量低，因而目前仍需大量進口。山竹果皮是果實食用后的廢棄物，比重可達鮮果的50%以上，纖維含量大，直接舍棄易造成環境污染，同時也是一種資源的浪費。現代生理學研究表明，山竹果皮中含有多種具有生物活性的化合物，常見的如果膠、黃酮、多酚、多糖等[2]。目前，關于山竹果皮中生物活性物質的研究集中于黃酮[3]、多酚[4]等，而對多糖的提取及性質研究較少涉及。

多糖是由單糖分子經苷羥基脫水縮合而成的高分子化合物，是生命體中的能源物質并且具有廣泛的生物活性[5]，普遍存在于動植物體內。水提法為提取多糖最常用的方法。試驗者常將提取體系置于超聲波氛圍中，利用超聲波的機械作用破壞細胞組織以提高提取效率[6]。旨在通過超聲波輔助水提法從山竹果皮中提取多糖以深度優化工藝條件，并采用體外測試的方法考察多糖的抗氧化活性，為加快山竹果實的綜合開發及產品應用提供理論依據及數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮泰國山竹：果皮鮮亮無黑點無腐敗，百色市右江區水果指南學院店；三氯乙酸、連苯三酚、ABTS、DPPH、三羥基氨基甲烷、鐵氰化鉀、抗壞血酸（分析純）：北京華威銳科化工有限公司；乙醇、98%硫酸、苯酚及其它常用化學試劑（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

高功率數控超聲波清洗器（KQ-400KDV）：上海蓮臣生物科技發展有限公司；紫外分光光度計（UV-2700）：島津企業管理（中國）有限公司；智能數顯電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9030A）：上海坤天試驗室儀器有限公司；恒溫水浴振蕩器（SHA-B）：浙江力辰儀器科技有限公司；旋轉蒸發儀（RE-2000B）：鞏義市宇翔儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

準確移取0.600 0 mg/mL葡萄糖標準溶液0.00、1.00、3.00、5.00、7.00、9.00 mL，純水定容至 100 mL，配制濃度分別為 0.00、6.00、18.00、30.00、42.00、54.00 μg/mL葡萄糖待測液。分別移取1.00 mL上述各個濃度葡萄糖待測液至潔凈的試管中，隨后依次加入2.00 mL純水、1.50 mL 5.0%苯酚溶液，振蕩均勻。繼續加入6.00 mL 98%硫酸，35℃水浴恒溫30 min。冷卻至25℃，在296 nm下測定體系吸光度Q，擬合吸光度Q對葡萄糖濃度cg（μg/mL）的回歸方程：Q=2.113×10-3cg+3.583，R2=0.999 4。

1.2.2 山竹果皮粉末樣品的制備

取新鮮的泰國山竹果，取殼并切成1 cm×1 cm的碎塊，60℃干燥至恒重（前后兩次質量差＜0.01 g）。打粉，過60目分樣篩獲取果皮粉末樣品。將果皮粉末樣品置于自封袋密封，于低溫（2℃～4℃）條件下保存并保證干燥，備用[7]。

1.2.3 山竹果皮多糖的提取及提取率測定

稱取一定質量的山竹果皮粉末，與相應比例的提取溶劑順序加入提取燒瓶中。隨后，將提取燒瓶置于超聲環境內，在已設定的提取溫度、超聲時間、超聲功率等條件下反復提取3次。合并提取液，濃縮至50 mL，Sevag法除蛋白，過濾除去不溶性雜質，加純水稀釋并定容至100 mL即得多糖提取液[8-9]。按照1.2.1所示流程測定多糖提取液的吸光度，計算多糖濃度和多糖提取率（%）：

多糖提取率/%=cpv/m×100

式中：cp為提取液多糖濃度，mg/mL；v為提取液體積，mL；m為山竹果皮粉末質量，mg。

1.2.4 單因素試驗研究

以1.000 g山竹果皮粉末為基準，固定其它因素及相應的水平，提取溫度45℃，超聲時間20 min，超聲功率 200 W，研究不同液料比20∶1、30∶1、40 ∶1、50 ∶1、60∶1（mL/g）對山竹果皮多糖提取率的影響效果；固定其它因素及相應的水平：液料比50∶1（mL/g），超聲時間20 min，超聲功率200 W，研究不同提取溫度35、45、55、65、75℃對山竹果皮多糖提取率的影響效果；固定其它因素及相應的水平，液料比50∶1（mL/g），提取溫度45℃，超聲功率200 W，研究不同超聲時間10、15、20、25、30 min對山竹果皮多糖提取率的影響效果；固定其它因素及相應的水平，液料比50∶1（mL/g）、提取溫度45℃、超聲時間25 min，研究不同超聲功率120、160、200、240、280 W 對山竹果皮多糖提取率的影響效果[10-11]。

1.2.5 響應面優化設計

根據單因素試驗結果了解所考察因素對多糖提取率的影響情況，確定其中具備顯著影響效果的因素及相關水平。多糖提取率設定為響應值，相關因素設定為自變量，利用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法設計并安排優化試驗方案[12-15]，如表1所示。

1.2.6 多糖純化

合并多批次多糖提取液并濃縮至100 mL，過濾并轉移至1.0 L錐形瓶中，混合4倍體積的95%乙醇，靜置于冰柜中低溫（4℃）醇沉。72 h后取出，抽濾，收集棕黑色固體，為粗多糖。稱取一定量的粗多糖，用盡可能少的純水溶解后轉移至纖維素柱內，純水淋洗得無色透明的純多糖溶液[16-17]。測定多糖濃度，并配制系列濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的多糖待測液。

表1 響應面優化試驗設計因素水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.7 多糖體外抗氧化活性測定

1.2.7.1 對·OH清除效果的測定

取5支潔凈試管，分別依次加入1.00 mL各個濃度的多糖待測液、2.00 mL 6.000 mmol/L硫酸亞鐵溶液、2.00 mL 6.000 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、2.00 mL 6.000 mmol/L過氧化氫溶液，振蕩均勻，37℃水浴恒溫30 min，并在510 nm下測定體系吸光度Ex。固定上述試驗流程及相應條件，以蒸餾水取代過氧化氫溶液為對照體系，測定對照吸光度ET；以蒸餾水取代多糖待測液為空白體系，測定空白吸光度E0，按如下公式計算山竹果皮多糖對·OH的清除率[18-19]：

η/%=[E0-（Ex-ET）]/E0× 100

1.2.7.2 對·O2-清除效果的測定

取5支潔凈試管，分別依次加入1.00 mL各個濃度的多糖待測液、4.50 mL pH=8.2 Tris-HCl緩沖溶液、0.40 mL 2.500 mmol/L連苯三酚溶液，振蕩均勻，25℃水浴恒溫25 min，并在4 min內每隔30 s在320 nm下測定一次體系的吸光度，獲取連苯三酚在多糖存在時的自氧化速率Kx。固定上述試驗流程及相應條件，以純水取代多糖溶液進行試驗，獲取連苯三酚在無多糖存在時的自氧化速率K0，并按如下公式計算山竹果皮多糖對·O2-的清除率[20-21]：

η/%=（K0-Kx）/K0× 100

1.2.7.3 對DPPH自由基清除效果的測定

取5支潔凈試管，分別依次加入1.00 mL各個濃度的多糖待測液、2.50 mL 0.200 0 mmol/L DPPH-乙醇溶液，振蕩均勻，25℃水浴避光恒溫30 min，測定體系吸光度Nx。固定上述試驗流程及相應條件，以95%乙醇取代DPPH乙醇溶液為對照體系，測定對照吸光度NT；以純水取代多糖待測液為空白體系，測定空白吸光度N0，按如下公式計算山竹果皮多糖對DPPH自由基的清除率[22-23]：

η/%=[N0-（Nx-NT）]/N0× 100

1.2.7.4 總還原力的測定

取5支潔凈試管，分別依次加入1.00 mL各個濃度的多糖待測液、3.00 mL pH=7.0磷酸緩沖溶液、3.00 mL 0.9%鐵氰化鉀溶液，振蕩均勻，65℃水浴恒溫30 min。冷卻至25℃，繼續向反應體系中加入2.50 mL 10%三氯乙酸溶液，3 000 r/min離心10 min。取上清液，加入1.00 mL 1.0%三氯化鐵溶液，25℃反應10 min，在719 nm下測定體系吸光度Sx。固定上述試驗流程及相應條件，以純水取代鐵氰化鉀溶液為對照體系，測定對照吸光度ST；以純水取代多糖待測液為空白體系，測定空白吸光度S0，按如下公式計算山竹果皮多糖的總還原力（總還原力與吸光度成正比）[24-25]：

η=Sx-ST-S0

1.3 數據處理

本課題中使用Origin 9.0作圖；采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken法設計優化試驗方案并對所得數據進行處理，獲取回歸模型及最佳提取工藝參數。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗解析

2.1.1 液料比變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢液料比變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢見圖1。

圖1 液料比變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢Fig.1 The effect of liquid-material ration on extraction of polysaccharides

如圖1所示，當溶劑添加量較少時，多糖提取率隨液料比的加大而升高。當液料比升至50∶1（mL/g）時，多糖提取率升高至最高值6.60%。當液料比繼續升高時，多糖提取率反而開始緩慢下降。隨著溶劑量的增加，增大的擴散壓促使多糖分子盡可能多的游離到溶液中，多糖提取率隨之升高。但溶劑量過大，多糖分子被溶出的同時其它雜質也被溶出。大量雜質分子的存在會擠占多糖的溶出空間，導致其提取率不升反降。溶劑量的增大亦使后續工作量加大，綜合以上情況，液料比設定在50∶1（mL/g）比較合適。

2.1.2 提取溫度變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢

提取溫度變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢見圖2。

圖2 提取溫度變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢Fig.2 The effect of temperature on extraction of polysaccharides

如圖2所示，提取溫度設定為35℃時，多糖提取率僅為4.95%。當提取溫度升高至45℃時，多糖提取率升高至最高值6.48%。提取溫度若繼續升高，多糖提取率則開始迅速下降。多糖作為有機物質對溫度變化十分敏感。在適度范圍內，多糖分子的活性隨溫度升高而增加并加速溶出，提取率隨之上升。但是，多糖的分子結構在高溫環境中易被破壞，導致其喪失生物活性并以絮狀沉淀的形式脫離體系，提取率下降。因而，提取溫度設定為45℃較為合適。

2.1.3 超聲時間變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢

超聲時間變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢見圖3。

圖3 超聲時間變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢Fig.3 The effect of ultrasonic time on extraction of polysaccharides

如圖3所示，在一定時間范圍內，多糖提取率隨超聲時間的延長而升高，當超聲時間設定為25 min時，多糖提取率升高至最高值6.38%。繼續延長超聲時間則導致多糖提取率有一定程度的下降。超聲波主要通過機械作用破壞細胞壁，促進多糖分子的溶出。隨著超聲時間的延長，細胞壁被充分破碎，多糖分子被充分溶出，提取率隨之上升。但時間過長，多糖分子的化學鍵積存過多的超聲能量易斷裂，導致多糖失活并析出，提取率下降。因而，超聲時間設置為25 min比較合適。

2.1.4 超聲功率變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢

超聲功率變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢見圖4。

圖4 超聲功率變動對山竹果皮多糖提取率的影響趨勢Fig.4 The effect of ultrasonic power on extraction of polysaccharides

如圖4所示，當超聲功率設定在200 W以下時，多糖提取率隨超聲功率的增加而升高。當超聲功率設定在200 W～300 W時，多糖提取率波動相對穩定并在240 W時升高至最高值6.02%。若超聲功率進一步增加，多糖提取率明顯下降。超聲功率增大，在促進多糖分子溶出的同時加劇體系的空化作用，導致分子聚集并產生局部高溫。多糖分子受高溫影響容易失去活性并以沉淀形式析出，提取率下降。因而，超聲功率設置在240 W時比較合適。

2.2 響應面法優化提取工藝解析

2.2.1 響應面法優化試驗設計與數據分析

分析山竹果皮多糖提取的單因素試驗結果可知，超聲功率變動對多糖提取率的影響效果較低，為考察因素中的次要因素。因此，多糖提取率設定為響應值（Y），液料比（A）、提取溫度（B）、和超聲時間（C）設定為自變量，利用Design-Expert軟件中的Box-Behnken法對試驗方案進行優化設計，安排并實施17個試驗點，試驗點方案及相應結果如表2所示。

表2 響應面法優化試驗方案及相應結果Table 2 Response surface optimized experiments design and results

2.2.2 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗

利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面法優化試驗方案的結果進行分析，獲得了多糖提取率（Y）對液料比（A）、提取溫度（B）、超聲時間（C）等因素的三元二次回歸方程：

Y=+1.031 44+0.140 75A+0.068 400B+0.043 000C+1.000 00×10-3AB+1.000 00×10-3AC-3.500 00×10-4BC-2.172 50×10-3A2-1.347 50×10-3B2-1.990 00×10-3C2

表3為回歸模型的方差分析表。

表3 回歸模型的方差分析表Table 3 Variance analysis of regression model

所得回歸模型p＜0.000 1，極顯著；失擬項p=0.117 8，說明所得方程與試驗過程具有極好的擬合度，可利用該方程分析及預測多糖提取率隨相關因素變化的波動情況。

考察因素 A（p=0.000 1）、B（p=0.000 2）、C（p=0.001 0）及其二次項A2（p＜0.000 1）、B2（p＜0.000 1）、C2（p=0.004 0＜0.01）對多糖提取率的影響均極顯著，且顯著性順序為A＞B＞C。同時，各因素之間存在交互作用，其中交互作用 AB（p＜0.000 1）、AC（p=0.004 4＜0.01）影響極顯著，BC（p=0.191 6＞0.05）影響不顯著。

2.2.3 交互作用分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件做出相應因素之間的交互作用分析圖，如圖5～圖7所示。

圖5 交互作用AB對多糖提取率的影響Fig.5 The effect of interactive AB on extraction of polysaccharides

圖6 交互作用AC對多糖提取率的影響Fig.6 The effect of interactive AC on extraction of polysaccharides

圖7 交互作用BC對多糖提取率的影響Fig.7 The effect of interactive BC on extractive of polysaccharides

交互作用影響多糖提取率的顯著性正比于響應面的坡度，坡度越大說明該交互作用的影響越顯著。交互作用AB的響應面具有明顯的下滑坡面，交互作用AC下滑坡度略低于AB，而交互作用BC各面均平緩下滑，坡度不明顯，說明交互作用AB、AC對多糖提取率影響極顯著，而交互作用BC影響不顯著。等高線的軸向密度越高，說明該交互作用越顯著，交互作用AB的等高線密度最大，交互作用AC、BC的密度依次降低，說明影響的顯著性順序為AB＞AC＞BC，這與方差分析的結果一致。

2.2.4 最佳提取工藝參數的確定及試驗驗證

利用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面法優化試驗方案的結果進行分析，確定了最佳工藝的參數：液料比 49.10∶1（mL/g）、提取溫度 46.17℃、超聲時間26.07 min，在此條件下，山竹果皮多糖提取率可達6.72%。為方便試驗操作，調整工藝參數：液料比49 ∶1（mL/g）、提取溫度 46℃、超聲時間 26 min。在上述條件下，超聲功率設定為240 W，平行試驗5次，山竹果皮多糖的實測平均提取率為（6.51±0.17）%，與回歸模型預測值6.72%相近（相對誤差<3.2%），說明該工藝條件可行。

2.3 山竹果皮多糖體外抗氧化活性測試解析

2.3.1 山竹果皮多糖對·OH清除效果的測定

山竹果皮多糖對·OH的清除效果見圖8。

圖8 山竹果皮多糖對·OH清除效果的測定Fig.8 The scavenging effect of polysaccharides on·OH

羥基是生命體中最具氧化性能的自由基，若不能及時清除，將對機體腑臟器官產生極大的破壞。圖8顯示，山竹果皮多糖對·OH具有較好的清除效果，在所研究的濃度范圍內，其清除效果隨多糖濃度的增加而增強。當多糖濃度為1.0 mg/mL時，對·OH的清除率可達79.06%，但低于VC清除·OH的能力。

2.3.2 山竹果皮多糖對·O2-清除效果的測定

山竹果皮多糖對·O2-的清除效果見圖9。

圖9 山竹果皮多糖對·O2-清除效果的測定Fig.9 The scavenging effect of polysaccharides on·O2-

·O2-是生命體中含氧自由基的原始形態，反應形式多樣。圖9顯示，山竹果皮多糖對·O2-具有極好的清除效果，在所研究的濃度范圍內，其清除效果隨多糖濃度濃度的增加而增強，并且在高濃度條件下清除率的增速加快。當多糖濃度為1.0 mg/mL時，對·O2-的清除率可達81.57%，明顯低于VC清除·O2-的能力。

2.3.3 山竹果皮多糖對DPPH自由基清除效果的測定

山竹果皮多糖對DPPH自由基的清除效果見圖10。

圖10 山竹果皮多糖對DPPH自由基清除效果的測定Fig.10 The scavenging effect of polysaccharides on DPPH radical

圖10顯示，山竹果皮多糖對DPPH自由基具有較強的清除能力，在所研究的濃度范圍內，其清除效果隨多糖濃度的增加而增強，但在高濃度條件下清除率增速逐漸降低。當多糖濃度為1.0 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達79.23%，明顯低于VC清除DPPH自由基的能力。

2.3.4 山竹果皮多糖總還原力的測定

山竹果皮多糖的總還原力見圖11。

圖11 山竹果皮多糖總還原力的測定Fig.11 The investigation of polysaccharides’total reducing power

多糖分子中含有苷羥基，在一定條件下可以異變為羰基結構，因而具有一定的還原性能。圖11顯示，山竹果皮多糖具有較好的還原性能，在所研究的濃度范圍內，總還原力隨多糖濃度的增加而增強，但在高濃度條件下總還原力的增速減慢。當多糖濃度為1.0 mg/mL時，其總還原力達到0.698，明顯低于VC的還原能力。

3 結論

采用超聲波輔助水提法從山竹果皮中提取多糖。單因素試驗的研究結果明確了各因素影響多糖提取效果的顯著性順序，以此為基礎利用響應面法對提取工藝進行優化，獲得了該工藝的回歸方程。方差分析表明，該回歸方程與提取試驗具有極高的擬合度，可用于試驗分析，并確定了該工藝的最佳參數：液料比49∶1（mL/g）、提取溫度 46℃、超聲時間 26 min、超聲功率240 W。在此條件下，多糖的實測平均提取率為（6.51±0.17）%，與模型預測值6.72%相近（相對誤差<3.2%），說明該工藝條件可行。多糖的體外抗氧化活性測試結果表明，山竹果皮多糖對含氧、含氮自由基均具有較好的清除效果。當多糖濃度為1.0 mg/mL時，對·OH、·O2-、DPPH自由基的清除率分別達到79.06%、81.57%、79.23%，總還原力達到0.698，并且其性能隨多糖濃度的增加而增加。本課題的研究為山竹果皮多糖的提取及山竹高附加值產品的開發提供數據支持。