Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)研發(fā)新型開(kāi)菲爾乳酒

文星科，王琪，2，劉琨毅，3，*

（1.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院五糧液技術(shù)學(xué)院，四川宜賓644003；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢430070；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明650000）

我國(guó)傳統(tǒng)的開(kāi)菲爾乳酒是在鮮奶中加入天然發(fā)酵劑，經(jīng)自然發(fā)酵形成，但由于天然發(fā)酵劑中菌群結(jié)構(gòu)各異致使傳統(tǒng)乳酒產(chǎn)品質(zhì)量經(jīng)常出現(xiàn)不穩(wěn)定現(xiàn)象[1-4]。因此菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且能顯著提高乳酒感官特性的發(fā)酵劑將受到廣泛地關(guān)注[5-8]。閔建等發(fā)現(xiàn)制備乳酒時(shí)使用兩種及兩種以上菌種可以提供產(chǎn)品質(zhì)量，當(dāng)酵母菌聯(lián)合乳酸菌，乳酒的品質(zhì)能得到顯著提升[9-12]。由開(kāi)菲爾菌生產(chǎn)的開(kāi)菲爾酸奶不僅與普通酸奶有類(lèi)似的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，而且具有一定的保健功能[13-16]。當(dāng)釀酒酵母與其他適宜的微生物混合作為發(fā)酵劑發(fā)酵酒品時(shí)，可以改善酒品的風(fēng)味，增強(qiáng)酒品的香氣特征[17-20]。因此試驗(yàn)以開(kāi)菲爾菌與釀酒酵母為發(fā)酵劑制備新型開(kāi)菲爾乳酒，并通過(guò)優(yōu)化其發(fā)酵工藝條件，以期開(kāi)發(fā)出一種酒體風(fēng)味優(yōu)雅、口感幼滑、酸度適中的新型開(kāi)菲爾乳酒，為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）滬釀2.069、開(kāi)菲爾菌粒（Kefir）：宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院菌種保藏中心；純牛奶（乳糖含量4.5%）、白砂糖：市售；檸檬酸、檸檬酸鈉、冰乙酸、乙酸鈉、磷酸氫鈉、乙醚等（均為分析純）：成都科龍有限公司；2-辛醇：美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MC-GNP-9080系列隔水式恒溫培養(yǎng)箱：青島明成環(huán)保科技有限公司；FA20043型電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)、PHS-25型精密pH計(jì)：上海力辰科技有限公司；KL-30-10000型乳化均質(zhì)機(jī)：上海科勞機(jī)械設(shè)備有限公司；AT6000型酒精度測(cè)試儀：意大利蓋博分析儀器公司；GC126型氣相色譜儀、DB-Wax（30m×0.25mm×0.25μm）毛細(xì)管柱：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵工藝流程

牛奶、白砂糖、亞硫酸鈉→加熱至60℃→15 MPa壓力條件下均質(zhì)→90℃加熱殺菌5 min→冷卻→接入開(kāi)菲爾菌粒與釀酒酵母→發(fā)酵→后熟→成品

操作要點(diǎn)：在牛奶中添加一定比例的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，利用檸檬酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)pH值為6.5，過(guò)濾后加熱至60℃，進(jìn)入乳化均質(zhì)機(jī)（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90℃加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無(wú)菌條件下接入一定量的經(jīng)活化后的酵母菌懸液和開(kāi)菲爾菌粒，25℃發(fā)酵，待發(fā)酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 理化指標(biāo)測(cè)定方法

總糖（以葡萄糖計(jì)）測(cè)定：斐林試劑法[21]；酒精體積分?jǐn)?shù)測(cè)定：密度瓶法[21]；總酸測(cè)定：電位滴定法[21]；氨基酸態(tài)氮測(cè)定：甲醛滴定法[21]。

1.4.2 乙酸乙酯的檢測(cè)

乙酸乙酯的檢測(cè)采用液-液微萃取法提取和氣相色譜法定量分析[22-23]。在5 mL發(fā)酵液中分別加入5 μL內(nèi)標(biāo)（2-辛醇）和500 μL乙醚。待乙醚充分萃取后取有機(jī)相進(jìn)行色譜分析。色譜條件為：進(jìn)樣口溫度設(shè)定為250℃，取1 μL的樣品，設(shè)置分流比1∶1，載氣流速2 mL/min，氫氣流速40 mL/min，空氣流速450 mL/min。升溫條件為：起始溫度150℃，保持3 min，隨后以10℃/min的升溫速率升溫至230℃，保留2 min。

1.4.3 感官評(píng)價(jià)

由13位三級(jí)品酒師組成的評(píng)定小組參照王璐等對(duì)馬奶酒發(fā)酵條件的研究[2]及GB/T 23546-2009《奶酒》[21]對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒從色澤（滿(mǎn)分5分）、組織形態(tài)（滿(mǎn)分5分）、香氣（滿(mǎn)分30分）、滋味（滿(mǎn)分40分）、典型性（滿(mǎn)分20分）5個(gè)方面進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，如表1所示。

表1 新型開(kāi)菲爾乳酒的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation standards of new Kefir koumiss

1.4.4 開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件的單因素試驗(yàn)

依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、開(kāi)菲爾粒接種量（0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%）、釀酒酵母接種量（0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發(fā)酵時(shí)間（2、3、4、5、6 d）對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分及乙酸乙酯含量的影響，以確定較佳的白砂糖添加量、開(kāi)菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間。

1.4.5 開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在較優(yōu)的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行分析試驗(yàn)[24]，以確定新型開(kāi)菲爾乳酒最佳的釀造工藝條件，因素水平如表2所示。

表2 新型開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

1.5 數(shù)據(jù)分析處理方法

試驗(yàn)采用OriginPro 12.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)制圖，PASW Statistics 18軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Design Expert 10.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 白砂糖添加量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響

白砂糖添加量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 白砂糖添加量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of sugar addition on quality of new Kefir koumiss

由圖1可知，當(dāng)開(kāi)菲爾乳酒中白砂糖添加量從6%增加到12%，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分也隨之增加；當(dāng)添加量達(dá)到12%時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分達(dá)到最高分（82.3±0.8）分。但隨著白砂糖添加量的繼續(xù)增加，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分開(kāi)始呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)。發(fā)酵醪液中乙酸乙酯的含量隨白砂糖添加量的增加而增加，最高達(dá)到了（0.75±0.02）g/L。可發(fā)酵性糖在開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵過(guò)程中主要轉(zhuǎn)化為乙醇，也可以轉(zhuǎn)化成酸類(lèi)、酯類(lèi)、醛類(lèi)等物質(zhì)[8]。開(kāi)菲爾乳酒在發(fā)酵過(guò)程中，可發(fā)酵性糖偏少會(huì)出現(xiàn)酒體不豐滿(mǎn)、香味不足的現(xiàn)象，而可發(fā)酵性糖過(guò)多則會(huì)造成酒體酸度偏大等不良現(xiàn)象。故選用白砂糖添加量為10%、12%及14%用于后續(xù)響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.1.2 開(kāi)菲爾粒接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響

開(kāi)菲爾粒主要由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌及明串珠菌等多種微生物組成，在開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生丁二酮、乙醇、丙醛、羥丁酮等揮發(fā)性羰基化合物，從而賦予開(kāi)菲爾乳酒獨(dú)特的風(fēng)味[13，25]。其用量的多少將直接決定著開(kāi)菲爾乳酒質(zhì)量的好壞，開(kāi)菲爾粒接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響如圖2所示。

圖2 開(kāi)菲爾粒接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of Kefir inoculums on quality of new Kefir koumiss

由圖2可知，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分隨著開(kāi)菲爾粒接種量的增加而呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)開(kāi)菲爾粒接種量為1.2%時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（80.2±0.6）分。因開(kāi)菲爾粒接種量不足會(huì)造成開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵不完全，酸味不足、香味較寡淡等不良特征，接種量過(guò)大又會(huì)使開(kāi)菲爾乳酒呈現(xiàn)出較高的酸度，甚至出現(xiàn)苦味（特別是在開(kāi)菲爾粒接種量為1.8%時(shí)）。但開(kāi)菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量隨開(kāi)菲爾粒接種量的增加而呈現(xiàn)出不斷增加的趨勢(shì)，最高達(dá)到了（0.71±0.05）g/L。綜合感官評(píng)分與乙酸乙酯的含量變化，選擇開(kāi)菲爾粒接種量為0.9%、1.2%、1.5%作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平。

2.1.3 釀酒酵母接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響

釀酒酵母接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。

圖3 釀酒酵母接種量對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiaeon inoculums on quality of new Kefir koumiss

由圖3可知，當(dāng)釀酒酵母接種量在0.4%以?xún)?nèi)變化時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分隨著釀酒酵母接種量的增加而不斷增加。當(dāng)釀酒酵母接種量為0.4%時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（82.4±0.9）分。釀酒酵母在發(fā)酵過(guò)程中能將可發(fā)酵性糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇，同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物質(zhì)[17-18]。當(dāng)釀酒酵母接種量偏低時(shí)，容易使釀酒原料不能完全發(fā)酵，造成開(kāi)菲爾乳酒酒度偏低、酒香不突出等現(xiàn)象。當(dāng)釀酒酵母的接種量為0.5%時(shí)，其開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分較釀酒酵母接種量為0.4%時(shí)略有下降，但兩者并無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。開(kāi)菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量隨酵母接種量的增加而不斷增加，最高達(dá)到了（0.79±0.04）g/L。因此，選擇釀酒酵母接種量為0.3%～0.5%用于響應(yīng)面法試驗(yàn)。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of fermentation time on quality of new Kefir koumiss

由圖4可知，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分達(dá)到最高的（82.0±0.5）分。雖然開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分在其發(fā)酵5 d時(shí)較發(fā)酵6 d時(shí)偏低，但二者并無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。開(kāi)菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量也隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為6 d時(shí)，開(kāi)菲爾乳酒中乙酸乙酯的含量達(dá)到了（0.87±0.05）g/L。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間少于5 d時(shí)，醪液中的可發(fā)酵性糖還未完全被微生物所利用，酒體略顯寡淡，乙酸乙酯等酒香物質(zhì)含量偏低，使得開(kāi)菲爾乳酒的酒香不夠濃郁。因此選擇發(fā)酵時(shí)間為4、5、6 d用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)

根據(jù)Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理與試驗(yàn)，對(duì)白砂糖添加量、開(kāi)菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素分析得到以下試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 新型開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵工藝條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

再通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)面法試驗(yàn)得到的感官評(píng)分與乙酸乙酯含量進(jìn)行方差分析，得到結(jié)果如表4與表5所示。

表4 感官評(píng)分的回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model for sensory score

表5 乙酸乙酯含量的回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for the content of ethyl acetate

由表4可知，4個(gè)因素對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分影響的強(qiáng)弱順序依次為：白砂糖添加量＞開(kāi)菲爾粒接種量＞發(fā)酵時(shí)間＞釀酒酵母接種量，其中白砂糖添加量對(duì)開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分的影響極為顯著（p＜0.01）。白砂糖添加量與開(kāi)菲爾粒接種量之間具有顯著的交互作用（p＜0.05）。設(shè)白砂糖添加量、開(kāi)菲爾粒接種量、釀酒酵母接種量、發(fā)酵時(shí)間分別為A、B、C、D，以新型開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分為響應(yīng)值，經(jīng)多元回歸擬合后，得到新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分回歸方程：新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分=87.48+1.85A-0.66B+0.19C-0.65D-2.25AB-0.025AC+0.62AD+0.27BC-0.85BD-1.02CD-3.15A2-4.44B2-2.74C2-1.62D2

由表5知，A、B、C、D 4個(gè)因素中A因素對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒乙酸乙酯含量的影響顯著（p＜0.05），交互項(xiàng)AB對(duì)乙酸乙酯含量的影響顯著（p＜0.05），二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)乙酸乙酯含量的影響極顯著（p＜0.01），得到的新型開(kāi)菲爾乳酒乙酸乙酯含量的回歸方程：乙酸乙酯含量=0.900+0.0140A-0.007B+0.007C-0.007D-0.023AB-0.015AC+0.006AD+0.003BC-0.009BD-0.010CD-0.035A2-0.054B2-0.029C2-0.025D2

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用[26-30]。根據(jù)新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分回歸方程與乙酸乙酯含量的回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖結(jié)果見(jiàn)圖5與圖6。

圖5 各因素交互作用對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒感官評(píng)分的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of new Kefir koumiss

由圖5知，A（白砂糖添加量）與B（開(kāi)菲爾粒接種量）之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭即A與B相互之間具有最強(qiáng)的交互作用。該結(jié)果與表4方差分析所得的白砂糖添加量與開(kāi)菲爾粒接種量之間具有顯著的交互作用（p<0.05）的結(jié)論相吻合。

圖6 各因素交互作用對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒乙酸乙酯含量的響應(yīng)面曲線及等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on the content of ethyl acetate in new Kefir koumiss

由圖6知，A與B之間所形成的響應(yīng)面曲面坡度在乙酸乙酯含量為響應(yīng)值的兩因素交互作用響應(yīng)面圖中最為陡峭即A與B相互之間具有最強(qiáng)的交互作用，與表5方差分析的結(jié)論相吻合。

通過(guò)響應(yīng)面分析確定新型開(kāi)菲爾乳酒的最佳發(fā)酵工藝條件為白砂糖添加量12.89%、開(kāi)菲爾粒接種量1.19%、釀酒酵母接種量0.43%及發(fā)酵時(shí)間4.82 d，此條件下由公式算出的感官評(píng)分與乙酸乙酯含量的理論值分別為87.86分、0.954 g/L。根據(jù)所得的分析數(shù)據(jù)進(jìn)行3組驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)的條件為白砂糖添加量12.9%、開(kāi)菲爾粒接種量1.2%、釀酒酵母接種量0.4%及發(fā)酵時(shí)間115 h，得到新型開(kāi)菲爾乳酒的感官評(píng)分為（88.1±0.3）分、乙酸乙酯的含量為（0.95±0.01）g/L，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，偏差不大，證明該結(jié)果合理可靠。

2.3 開(kāi)菲爾乳酒的理化分析及感官分析

測(cè)定在最佳發(fā)酵工藝條件下新型開(kāi)菲爾乳酒（Z1）及在最佳發(fā)酵工藝條件下但未接入釀酒酵母的開(kāi)菲爾乳酒（Z0）的總糖、酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙酸乙酯等理化指標(biāo)及感官評(píng)分，其數(shù)值見(jiàn)表6。

由表6可知，Z1的酒精度、總酸、氨基酸態(tài)氮、乙酸乙酯及感官評(píng)分均高于Z0，特別是乙酸乙酯的含量是Z0的1.76倍，表明釀酒酵母在新型開(kāi)菲爾乳酒發(fā)酵過(guò)程中能賦予產(chǎn)品風(fēng)味特別是能賦予更加濃郁的乙酸乙酯酒香進(jìn)而提高產(chǎn)品的感官特性。其原因是釀酒酵母與醋酸菌等其它微生物共同接入發(fā)酵醪液中，會(huì)促進(jìn)乙酸乙酯等風(fēng)味物質(zhì)的生成[31-32]。Z1呈現(xiàn)出色澤微黃、澄清透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿(mǎn)圓潤(rùn)、醇厚協(xié)調(diào)的感官特性；而Z0在酒香和酒體滋味方面較Z1有所欠缺，因而開(kāi)菲爾菌與釀酒酵母混合發(fā)酵有利于提高新型開(kāi)菲爾乳酒的感官特性。

表6 兩種開(kāi)菲爾乳酒的理化指標(biāo)及感官評(píng)分Table 6 Physicochemical indexes and sensory scores of two kinds of Kefir koumiss

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面法對(duì)新型開(kāi)菲爾乳酒的發(fā)酵工藝條件進(jìn)行了優(yōu)化，確定了其最優(yōu)工藝條件為：在牛奶中添加12.9%的白砂糖及0.02%的亞硫酸鈉，攪拌至白砂糖完全溶解，過(guò)濾后加熱至60℃，進(jìn)入乳化均質(zhì)機(jī)（壓力為15 MPa）均質(zhì)，均質(zhì)后在90℃加熱殺菌5 min；待樣品冷卻后，在無(wú)菌條件下接入1.2%的開(kāi)菲爾粒和經(jīng)活化后的0.4%釀酒酵母懸液，25℃發(fā)酵115 h后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此條件下可獲得色澤微黃透明、奶香與酒香和諧、酒體豐滿(mǎn)圓潤(rùn)的開(kāi)菲爾乳酒，其感官評(píng)分為88.1分、乙酸乙酯的含量為0.95 g/L。若需將此開(kāi)菲爾乳酒進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)還需對(duì)酒體進(jìn)一步勾調(diào)及澄清處理，使其感官特性符合商品要求。