脈沖染料激光聯合二氧化碳點陣激光對兔耳增生性瘢痕的影響

彭 曦 熊 維 黃海艷 鄒彥芬 姜 彬 劉小明 簡杏玲 于 波

北京大學深圳醫院皮膚科，深圳，518000

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，在白種人群中增生性瘢痕的發病率在5%～37%，在黑色人種中的發生率是白種人的5～15倍，而膚色較淺的亞洲人種發病率介于兩者之間[1]。其中，增生性瘢痕在臨床上表現為不超過傷口范圍的高出皮表面的瘢痕組織，好發于女性，早期充血明顯，伴瘙癢或疼痛等感覺，位于關節部位則可能會引起活動功能障礙，具有浸潤生長，易復發等一些類似腫瘤的特性，因此近年來被列為良性腫瘤的范圍[2]。目前瘢痕的發病機制不明確、治療手段多樣但效果均很有限，是皮膚科及整形科的難題之一[3]。目前常用的激光設備，如PDL的靶色基為血紅蛋白，選擇性加熱血紅蛋白，破壞血管內皮細胞，起到封閉血管的作用，CO2FL的靶色基為皮膚組織中的水分，加熱后刺激膠原纖維的增生與重塑。這兩種激光被多個臨床研究證實對增生性瘢痕的預防及治療均有效，有臨床研究[4，5]應用兩者聯合治療，證實有效，也有相應的動物實驗研究兩者聯合治療的效果及探討其機制[6]。本研究擬在兔耳動物模型上，比較兩種激光設備對增生性瘢痕的預防及治療作用，以明確聯合治療效果是否優于單種激光治療，以及早期干預對于增生性瘢痕的預防及治療是否重要。

1 材料與方法

1.1 兔耳瘢痕造模與分組 參考Morris等[7]報道的方法，構建兔耳增生性瘢痕模型，簡單敘述如下：選取20只雌性新西蘭大耳白兔，體重在2.5 kg左右，采用3%戊巴比妥鈉耳緣靜脈麻醉后，在兔雙耳腹側各做8處直徑為1 cm的全層皮膚及軟骨膜缺損切口，切口之間間距1 cm以上，每只兔耳選取造模成功6處切口進行后續實驗，共計選取240個切口。術后待創面自然愈合，正常飼養。待術后2周，所有創面愈合(即上皮化)后，隨機選取10只入上皮化實驗；剩余10只待術后4周瘢痕形成，入瘢痕實驗。上皮化實驗分為CON-1(對照組-1)、PDL-1組、CO2FL -1組和PDL+CO2FL-1(聯合組-1)；瘢痕實驗分為CON-2(對照組-2)、PDL-2組、CO2FL-2組和PDL+CO2FL-2(聯合組-2)。見圖1、2。

1.2 治療方案與取材 在上皮實驗和瘢痕實驗中：CON組不做任何治療干預；PDL組接受PDL激光(585 nm)治療，共2次，間隔2周，參數為能量5.5～8.5 J/cm2、脈寬0.5～2 ms、頻率1 Hz、光斑7 mm；CO2FL組接受CO2FL激光(10 600 nm)治療，共2次，間隔2周，參數為微脈沖60 mJ、密度5%、重復2～6次、光斑可調；聯合組在單次治療中先予以PDL治療，后即刻予以CO2FL治療(共2次，間隔2周，PDL和CO2FL的參數設置同上。考慮到兔耳不同部位的瘢痕有可能會對治療效果造成影響(例如兔耳邊緣及中央)，因此治療過程中每側兔耳隨機選擇不同的部位進行不同的激光治療。

關于取材方案，在上皮化實驗中，在上皮化后干預治療前(0天)和上皮化后2周(14天)、4周(28天)分別切取4組的增生性瘢痕，共計取材120處，用于組織學、RNA分析。瘢痕實驗取材方案與上皮化實驗相同。

1.3 觀察指標 具體觀察指標包括：①瘢痕增生指數(scar elevation index，SEI)：即SEI=(瘢痕厚度-正常兔耳厚度)/正常兔耳厚度；當SEI>1.6，認為存在明顯瘢痕，提示瘢痕增生模型成功。②瘢痕內成纖維細胞密度：采用HE染色法對瘢痕進行細胞學分析，按照HE染色試劑盒(武漢谷歌生物科技公司，G1005)步驟操作。在普通光學顯微鏡下觀察瘢痕塊的組織結構和成纖維分布，計算成纖維細胞密度，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內成纖維細胞數目，求出與視野面積的比值，并算出5個視野的平均成纖維細胞密度值。③膠原纖維面積百分比：采用Masson染色法對瘢痕進行膠原纖維形成情況分析，按照Masson染色試劑盒(Servicebio，G1006)步驟操作。在普通光學顯微鏡下觀察瘢痕塊的膠原纖維形成和分布，計算膠原纖維面積百分比，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內藍染的膠原纖維面積，求出該面積與組織總面積的比值，即膠原纖維面積百分比，并算出5個視野的平均膠原纖維面積百分比。④細胞凋亡率：采用TUNEL法評估瘢痕組織內細胞凋亡情況，按照TUNEL染色試劑盒(羅氏，11684817910)步驟操作。凋亡細胞的細胞核呈現淡棕色至深棕黃色顆粒。高倍鏡下，每張切片隨機選取3個陽性細胞最多的視野進行計數，計算凋亡細胞率(凋亡細胞數/總細胞數)，取3個視野的均數。⑤TGF-β1、Smad3基因的mRNA表達水平：提取瘢痕組織內的總RNA，采用RT-PCR方法，進行40個循環擴增， GAPDH為內參基因，采用靶基因量=2-δδCt公式計算TGF-β1、Smad3基因mRNA水平，采用比較Ct值方法以內參相對定量靶基因表達水平。引物設計如下：TGF-β1:(F)5’-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3’，(R)5’-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3’；Smad3:(F)5’-CAGCGACCACCAGATGAAC-3’,(R)5’-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3’；GAPDH:(F)5’-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3’,(R)5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0軟件進行統計學分析，P<0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 兔耳瘢痕增生指數變化情況 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯合組術后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均顯著下降，此外分別與PDL組和CO2FL組相比，聯合組的SEI均較相同時間點顯著下降(P<0.05)。結果提示聯合組較單獨處理治療更能有效預防上皮化后創面瘢痕增生。見表1、圖1。在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯合組術后14天(P<0.01)和28天(P<0.01)的SEI均顯著下降；分別與PDL組和CO2FL組相比，聯合組的SEI均較相同時間點顯著下降(P<0.05)。結果提示聯合PDL與CO2FL治療較單獨處理更能有效改善增生性瘢痕。見表1、圖2。

表1 兔耳瘢痕增生指數變化情況

注：與聯合組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2 瘢痕內成纖維細胞密度及膠原纖維面積變化情況 鑒于治療效果在28天可見顯著差異，我們進一步關注治療28天和治療前的效果比較。在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.01)均顯著下降，此外和CO2FL組相比，聯合組術后28天瘢痕內成纖維密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；而與PDL組相比未見明顯差異。結果提示聯合組較CO2FL處理治療更能有效預防上皮化后創面瘢痕增生。在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；與CO2FL組相比，聯合組術后28天瘢痕內成纖維細胞密度(P<0.05)和膠原纖維面積百分比(P<0.05)均顯著下降；而與PDL組相比未見明顯差異。結果提示聯合PDL與CO2FL治療較CO2FL處理更能有效改善增生性瘢痕。見表2。

2.3 瘢痕內細胞凋亡檢測結果 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯合組術后28天瘢痕內細胞凋亡率(P<0.01)顯著上升，此外與CO2FL組或PDL組相比，聯合組術后28天瘢痕內細胞凋亡率(P<0.05)顯著上升；提示聯合組較單獨處理治療更能有效促進上皮化后創面瘢痕內細胞凋亡。瘢痕實驗的結果趨勢與上皮化實驗趨勢相一致，結果提示聯合PDL與CO2FL治療較單獨處理更能有效促進增生性瘢痕內細胞凋亡。見圖3。

2.4 TGF-β1、Smad3的mRNA表達情況 在上皮化實驗部分，與對照組相比，聯合組術后28天瘢痕內TGF-β1和Smad3 mRNA水平(P<0.01)顯著下降，此外和CO2FL組或PDL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA均未見明顯差異；在瘢痕實驗部分，與對照組相比，聯合組術后28天瘢痕內TGF-β1 和Smad3 mRNA水平顯著下降(P<0.01)，與CO2FL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降(P<0.05)，而與PDL組相比，TGF-β1和Smad3 mRNA水平未見明顯差異。結果提示聯合組治療更有效抑制上皮化后及增生性瘢痕內TGF-β1和Smad3 mRNA水平上升。見圖4、5。

圖1 上皮化后創面瘢痕增生治療情況 1a、1b：上皮化創面;1c、1d:接受治療第14、28天 注：C為CO2FL，P為PDL，P+C為聯合組，(-)為對照組 圖2 增生性瘢痕治療情況 2a、2b：增生性瘢痕;2c、2d：接受治療第14、28天 注：C為CO2FL，P為PDL，P+C為聯合組，(-)為對照組

表2 兔耳瘢痕內成纖維細胞密度指標和膠原纖維面積百分比變化情況

注：*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

*P<0.05，**P<0.01

3 討論

增生性瘢痕的發病機制尚不完全清楚，治療效果有限，是研究的熱點與難點之一。其治療方法多種多樣，主要有：藥物治療、壓迫治療、放射治療、硅膠薄膜、生物治療、激光治療、基因治療等[4-8]。隨著激光技術的發展，多種激光設備被用于治療增生性瘢痕。目前已有動物實驗及臨床研究證實激光對增生性瘢痕有治療作用[9-11]。根據治療時期的不同可將其分成：前期以抑制瘢痕的血管增生為主；后期以抑制瘢痕的成纖維細胞增生，促進細胞凋亡為主；成熟期以削平凸起的瘢痕組織，促進膠原再生與表皮重建為主。由于激光設備和波長的不同,其作用機制可能不是單方面的,而是多種機制共同作用來治療瘢痕。針對血管治療的激光有：脈沖染料激光(PDL)585 nm、595 nm，Versa Pulse可調脈寬倍頻Nd:YAG532 nm，強脈沖光(IPL)等[12-14]。刺激膠原再生與組織重塑的代表性激光有2940 nm Er:YAG點陣激光、點陣CO2激光等[15]。

針對兔耳增生性瘢痕模型的研究：Kuo等[16]研究證實脈沖染料激光(PDL)可減少 TGF-β的表達，從而抑制成纖維細胞的增殖與分裂，減少膠原沉積。朱玉等[17]驗證不同治療周期PDL照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纖維細胞的增殖過程，誘導細胞凋亡，且1周治療組與2周治療組兩組無明顯差異。王家亮等[18]發現2940 nm點陣鉺激光能有效改善兔耳增生性瘢痕的厚度，降低瘢痕組織中VEGF的表達，從而達到治療目的，猜測2940 nm點陣鉺激光治療機制與改善瘢痕內血管與膠原的增生有關。譚軍等[19]證實點陣CO2激光治療兔耳增生性瘢痕使瘢痕軟化、完全平坦所需時間縮短、成纖維細胞數量明顯減少、膠原排列有序，成纖維細胞凋亡較對照組明顯增高，同時降低VEGF的表達，促進瘢痕的成熟與萎縮，達到治療的目的。李軍[6]通過比較治療前后瘢痕增生指數,免疫組織化學SP法檢測瘢痕組織中膠原蛋白I、III的水平，證實CO2點陣激光和595 nm脈沖染料激光聯合治療，有利于兔耳增生性瘢痕的治療,其機制與抑制膠原蛋白合成和改善膠原結構有關。

本研究通過對兔耳瘢痕進行激光治療后，進行病理切片HE染色觀察瘢痕增生指數及瘢痕內成纖維細胞密度，Masson染色觀察膠原纖維面積百分比，TUNEL法檢測瘢痕內細胞凋亡率，RT-PCR檢測TGF-β1、Smad3的mRNA表達，明確了PDL和CO2FL對增生性瘢痕的預防及治療均有效，且兩者聯合運用效果更好。在上皮化實驗及瘢痕實驗中，聯合治療組與未治療的對照組相比，均顯示有效；聯合治療組與PDL組、CO2FL組對比，多數顯示更有效。但在上皮化實驗及瘢痕實驗中，聯合組與PDL組的瘢痕內成纖維細胞密度及膠原纖維面積百分比，相比無顯著差異；聯合組與PDL組的TGF-β1、Smad3的表達無顯著差異。上皮化實驗的TGF-β1、Smad3的表達與CO2FL組無顯著差異。說明聯合治療有效，單一的PDL或CO2FL也有效果，但相對而言，聯合治療效果更佳。通過實驗發現，激光治療后TGF-β1和Smad3 mRNA水平下降，成纖維細胞凋亡增多，瘢痕內成纖維細胞及膠原纖維減少，因此可以推測激光治療通過下調TGF-β1-Smad3途徑促使成纖維細胞凋亡而抑制血管內皮細胞的增生，使膠原纖維的代謝恢復正常，促使瘢痕萎縮變平，從而達到治療效果。但實驗由于數據過多，未將上皮實驗與瘢痕實驗的數據做對比，因此很難得出提前干預瘢痕是否會有更好效果的結論。