QuEChERS萃取-UPLC-MS/MS測定花生醬中黃曲霉毒素B1方法的研究

梁劍鋒，李亞，梁燕妮，楊韶平

(梧州學院 化學工程與資源再利用學院，廣西 梧州 543002)

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等真菌毒素，在高溫高濕環境下產生的一種次生代謝物[1,2]。目前發現有20種黃曲霉毒素及其衍生物 ,其中以黃曲霉毒素B1毒性最強[3]，在1993年被國際癌癥研究機構列為Ⅰ類致癌物，對廣大人民群眾的健康產生巨大危害[4]?；ㄉ俏覈鴱V泛種植的經濟作物，以花生為原料加工的食品除了花生油外，還有調味品花生醬，由于其風味、香氣獨特而深受廣大群眾喜愛，但是花生在種植、運輸、儲存過程中容易受到黃曲霉和寄生曲霉污染，從而產生強致癌代謝物黃曲霉毒素B1[5]。所以，有必要開展花生醬中黃曲霉毒素B1的快速、準確、經濟檢測方法，以利于對其食品安全性進行有效控制。

目前，國內食品中的黃曲霉毒素B1常用的檢測方法有：酶聯免疫(ELISA)法、薄層色譜(TLC)法、氣相色譜(GC)法、高效液相色譜(HPLC)法、液質聯用儀法、免疫傳感法[6-12]。這些檢測方法是通過免疫親和柱凈化后，采用保留時間方法對黃曲霉毒素B1定性的，具有操作步驟繁瑣、檢測成本高、干擾物對結果影響大等缺點。QuEChERS是一種在蔬菜、糧食中農殘檢測的快速提取方法，可以有效去除提取液中蛋白、脂肪酸、磷脂、糖、色素等雜質，能夠有效提高檢測回收率[13]。將高效、經濟、快速的QuEChERS前處理方法，與高靈敏性、高選擇性的超高速液相色譜-質譜聯用儀聯合起來，建立適用于花生醬復雜基質樣品中黃曲霉毒素B1的快速檢測方法。

1 試驗部分

1.1 儀器與材料

LC1290-QQQ6490超高速液相色譜-質譜聯用儀(配電噴霧離子源 ) 美國安捷倫公司；XS105DU天平 瑞士梅特勒公司；ST16R高速冷凍離心機 美國熱電公司；Multi Reax渦旋混合器 德國Heidolph公司；Million Q超純水器 美國Millipore公司。

黃曲霉毒素B1標準品：濃度2.000 μg/mL，農業部環境保護科研檢測所；甲酸：色譜純，美國MREDA公司；乙腈、甲醇：色譜純，德國MERCK公司；無水硫酸鎂：分析純，西隴科學股份有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷吸附劑：PSA，上海安譜科學儀器有限公司；HC-C18填料：40～63 μm，上海安譜科學儀器有限公司；花生醬：市購。

1.2 樣品前處理

稱取5.0000 g攪拌均勻的花生醬置于50 mL聚乙烯離心管中，加入20.00 mL 1%甲酸-乙腈溶液搖勻，將離心管置于渦旋混合器上混合5 min，然后在冷凍離心機中5 min(轉速4000 r/min，溫度4 ℃)，取出后放置至室溫，準確吸取1.00 mL離心上清液，置于2.0 mL離心管中(預裝有無水硫酸鎂、HC-C18、PSA凈化試劑)，將離心管置于渦旋混合器上混合5 min后，在4 ℃下以15000 r/min冷凍離心8 min，取上清液過0.22 μm濾膜(初濾液棄去)，將濾液置于液相進樣瓶中，供上機測定。

1.3 標準溶液配制

黃曲霉毒素B1標準儲備液：吸取黃曲霉毒素B1標準品0.50 mL到10.00 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配制成100.0 ng/mL的標準儲備液，密封存儲于-20 ℃冰箱中(不超過1個月)。

黃曲霉毒素B1標準曲線：分別吸取100，200，300，400，500 μL黃曲霉毒素B1標準儲備液到10.00 mL棕色容量瓶中，乙腈定容至刻度，分別得到濃度為1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 ng/mL溶液。

1.4 色譜條件

流動相：A相0.1%甲酸溶液，B相乙腈，流動相梯度洗脫程序見表1；色譜柱：C18超高惰性硅膠柱(75 mm×2.1 mm×2.5 μm，ACE UltraCore C18)；柱溫：35 ℃；流速：0.35 mL/min；進樣量：1 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient elution procedure

1.5 質譜條件

離子源：ESI+；檢測模式：多反應監測(MRM)；霧化器壓力：40 psi；毛細管電壓：3500 V；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：9 L/min；監測離子對和其他參數見表2。

表2 質譜儀檢測參數Table 2 Detection parameters of mass spectrometer

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

花生醬的主要配料是花生仁、白砂糖、氫化油脂、食用鹽等，樣品中對檢測有影響的成分主要是高油(樣品中脂肪含量在40%～50%之間)、膠溶性雜質(主要是磷脂、蛋白、糖、食鹽成分)、脂溶性雜質(主要是游離脂肪酸、色素)等，因此選擇合適的提取溶液，可以降低基體帶來的干擾，提高試驗的回收率，綜合考慮樣品基體的特點和分析目標物特性后，試驗考察甲醇、酸化甲醇(1%甲酸)、乙腈、酸化乙腈(1%甲酸)、甲醇-乙腈(80∶20，V/V)等不同提取溶劑對試驗回收率的影響，試驗結果見圖1。

圖1 不同提取溶液對花生醬樣品回收率的影響Fig.1 Effect of different extracting solutions on the recovery rate of peanut butter samples

由圖1可知，花生醬樣品采用1%甲酸-乙腈溶液提取回收率最好?？赡苁怯捎诨ㄉu樣品含有大量脂肪，根據“相似相溶”的原理，乙腈能夠高效提取脂肪中黃曲霉毒素B1，同時1%甲酸-乙腈中甲酸能夠使花生醬中大量磷脂、蛋白等膠體干擾物質在提取過程中通過形成絮凝沉淀物離心去除，減少這些物質對目標分析物的吸附，從而達到進一步提高試驗回收率的作用。

2.2 凈化鹽包配比確定

2.2.1 鹽析劑無水硫酸鎂使用量

由于花生醬樣品在經過1%甲酸-乙腈溶液提取離心后，其上清液中還存在著大量共萃雜質，還會影響對目標分析，所以需要進一步采用鹽析的方法去除雜質。本試驗通過在凈化鹽包中添加無水硫酸鎂，去除提取液中水溶性雜質，考察無水硫酸鎂不同添加量對目標分析物回收率的影響，其結果見圖2。

圖2 鹽析劑無水硫酸鎂使用量對回收率的影響Fig.2 Effect of the usage amount of salting-out agent anhydrous magnesium sulfate on recovery rate

由圖2可知，隨著無水硫酸鎂使用量增加，目標分析物黃曲霉毒素B1回收率也在增加，但在無水硫酸鎂使用量達到250 mg后，目標物回收率出現了下降，此現象原因分析：由于無水硫酸鎂有強結合水的能力，其可以大量吸附提取液中水溶性雜質，同時可以飽和水溶液而使提取液分層，從而提高試驗萃取效率，但是大量無水硫酸鎂使用后，提取液中無水硫酸鎂會出現結塊現象，從而導致其與提取液接觸的面積減少，同時其吸水過程中產生大量熱量使提取液局部迅速升溫，從而導致目標分析物的回收率下降，所以凈化包中采用250 mg無水硫酸鎂比較合適。

2.2.2 凈化劑配方考核

圖3 凈化劑HC-C18使用量對黃曲霉毒素B1回收率的影響Fig.3 Effect of the usage amount of HC-C18 on recovery rate of aflatoxin B1

圖4 凈化劑PSA使用量對黃曲霉毒素B1回收率的影響Fig.4 Effect of the usage amount of PSA on recovery rate of aflatoxin B1

提取液中除了水溶性雜質外，還有一定量的磷脂、蛋白等非極性雜質，和糖類、脂肪酸等極性雜質影響分析結果，所以凈化包中通過采用一定量的HC-C18、PSA凈化物質，分別除去提取液中非極性、極性雜質，從而進一步提高試驗方法的回收率。本試驗考察HC-C18、PSA不同的添加量對花生醬基質提取液的凈化效果，以黃曲霉毒素B1回收率為考核的指標，結果見圖3和圖4。

由圖3和圖4可知，花生醬樣品采用100 mg HC-C18、50 mg PSA凈化配方，試驗目標分析物黃曲霉毒素B1回收率最高。

2.3 色譜/質譜條件的優化

試驗考察純水、0.1%甲酸溶液分別與乙腈、甲醇組成的流動相，對花生醬樣品目標分析物黃曲霉毒素B1保留時間與峰形的影響。

圖5 黃曲霉毒素B1標準溶液的MRM質譜圖Fig.5 MRM mass spectrogram of aflatoxin B1 standard solution

試驗結果表明：流動相采用乙腈洗脫效果明顯比甲醇好，同時在ESI+模式時，流動相加入0.1%甲酸溶液時，更容易誘導黃曲霉毒素B1產生[M+H]+，所以試驗采用0.1%甲酸-乙腈溶液為色譜的流動相。黃曲霉毒素B1標準溶液的MRM質譜圖見圖5。

3 試驗方法評價

3.1 方法線性考察

以黃曲霉毒素B1標準溶液濃度為橫坐標(X)，標準溶液響應值為縱坐標(Y)繪制標準曲線，結果表明黃曲霉毒素B1在1.00～5.00 ng/mL的質量濃度范圍內具有良好的線性關系，線性回歸方程Y=2110.2X+467.9，擬合度r2為0.9993。

3.2 方法檢出限

準確稱取樣品5.00 g(精確到0.0001 g)，加入150 μL的濃度為1.00 ng/mL的黃曲霉毒素B1標準溶液。按照1.2的前處理方法處理提取樣品，S/N=16.2，圖譜見圖6。

圖6 方法的檢出限色譜圖Fig.6 Detection limit chromatogram of the method

由于檢出限為各化合物的3倍信噪比即S/N=3就被定為最低檢出限(LOD)。測得數據顯示，檢出限目標分析物黃曲霉毒素B1信噪比S/N>3，可以確定方法的檢出限在0.03 μg/kg。

3.3 方法的回收率及精密度

在空白的花生醬樣品中，分別添加0.50，1.00，5.00，10.0 μg/kg 4個不同水平的黃曲霉毒素B1標準溶液，每個水平測定6次，按照1.2的前處理方法處理樣品，結果見表3。

表3 試驗方法的回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recovery rates and relative standard deviations of test methods (n=6)

由表3可知，本試驗方法的回收率在81.7%～93.5%范圍內，相對標準偏差(RSD)為2.4%～5.6%。表明該方法適用于樣品花生醬中黃曲霉毒素B1分析，試驗方法具有良好的回收率與精密度，符合GB/T 27404-2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求[14]。

3.4 實際樣品檢測

稱取市場上購買的3款花生醬(編號T1、T2、T3)，采用1.2的前處理方法處理，同時采用食品中黃曲霉毒素B1檢測國家標準GB 5009.22-2016第一法(液質)、第二法(柱前衍生)、第三法(柱后光化學衍生)進行檢測[15]，不同方法檢測結果見表4。

表4 本試驗方法與國標檢測方法檢測結果的比較Table 4 Comparison of testing results between this method and international standard testing methods

由表4可知，本文的試驗方法檢測結果與國標3種方法結果相比相對偏低，但是相對偏差都在5%以下，符合國標GB 5009.22-2016中方法精密度小于20%的要求。本試驗方法與目前的國標方法相比：在經濟成本上，由于前處理無需價格昂貴的免疫親和柱凈化，減少了檢測成本；在檢驗效率上，QuEChERS前處理過程簡單、快捷，易于大批量的花生醬樣品檢測，具有極高的檢測效率。

4 結論

本文建立了QuEChERS萃取-液質聯用儀快速檢測花生醬中黃曲霉毒素B1的方法，試驗采用250 mg無水硫酸鎂、100 mg HC-C18、50 mg PSA凈化提取包配方后進入液質聯用儀檢測，方法回收率在81.7%～93.5%范圍內，相對標準偏差(RSD)為2.4%～5.6%，檢出限為0.03 μg/kg。該方法具有方便、快捷、經濟、準確、回收率高等特點，適用于花生醬等容易受到黃曲霉毒素污染的樣品檢測與質量控制。