羥丙哌嗪手性拆分的HPCE新方法

張 思，沈靜茹，陸金富，覃信銘

(中南民族大學 化學與材料科學學院 分析化學國家民委重點實驗室，湖北 武漢 430074)

羥丙哌嗪(Dropropizine)是一種通過作用于外周受體及其傳入導體來抑制咳嗽反射的外周性鎮咳藥[1]。1988年由意大利 Dompe'Farm S.P.A公司研發上市[2]，它以外消旋形式或其純對映體銷售，兩者在世界范圍內都以各種藥物劑型(例如片劑，糖漿和口服溶液)獲得，由于優良的藥效性得到廣泛應用[3]。純左旋對映體的鎮咳效果與外消旋羥丙哌嗪相當，但中樞鎮靜反應明顯降低，且無藥物依賴性，羥丙哌嗪的藥物副作用主要來源于其右消旋體[4]。因此，有必要開發簡單、高效的方法分離測定手性藥物羥丙哌嗪。

目前，主要有高效液相色譜法(HPLC)實現羥丙哌嗪單一對映體的分析測定。Balaji等[5]從大鼠血漿中提取出羥丙哌嗪異構體，在甲醇和二乙胺為流動相的Chiralpak IG-3色譜柱上直接分離左羥丙哌嗪和右羥丙哌嗪，分離度Rs達到 4.45。黃勇等[6]在Chiracel-OC手性柱正相模式下，拆分了羥丙哌嗪對映體酯化產物，但未能實現羥丙哌嗪的直接分離。與HPLC相比，高效毛細管電泳(HPCE)具有靈敏度高、分辨率高和成本低等特點，已成為對映體分離領域的有力手段。衍生化的β-環糊精(CD)是目前研究最廣泛的手性HPCE拆分的選擇劑之一，其中有些β-CD衍生物與手性分子相互作用較強，由于靜電相互作用易于形成包合，顯現出較好的對映體選擇性。論文采用組氨酸-β-環糊精(β-CD-E2)衍生物制成HPCE手性整體柱并用于羥丙哌嗪消旋體的手性拆分，優化了拆分條件后構建了羥丙哌嗪對映體手性拆分的HPCE新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

負電源高效毛細管電泳儀(CL1020，北京彩陸科學儀器有限公司)，自動電位pH滴定計(ZD-2型，上海偉業儀器廠)，微孔濾膜(0.22 μm，津騰歐美國家進口膜)，三羥甲基氨基甲烷(Tris，陶氏化學公司)，一水合檸檬酸、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)和檸檬酸三鈉(國藥集團化學試劑有限公司)，磷酸(H3PO4，天津科密歐化學試劑有限公司)，羥丙哌嗪標準品(98.5%，阿拉丁試劑)，β-CD-E2毛細管整體柱(實驗室自制)。

1.2 電泳條件

用于測定目標化合物的波長為254 nm，在制備的毛細管整體柱(有效長度40 cm×φ75 μm)上進行樣品分析。首次使用整體柱用HCl和水各沖洗30 min，每次在開始實驗之前，毛細管整體柱用水沖洗10 min，用背景電解質(BGE)加電場處理30 min。羥丙哌嗪樣品在手動壓力下進樣20 s，采用負電源模式，對樣品進行分離分析。所有溶液均經0.22 μm濾膜過濾。

2 結果與討論

2.1 探究緩沖體系對羥丙哌嗪對映體分離的影響

電泳儀上設置電壓-20 kV，背景緩沖液pH值4.00，濃度50 mmol/L，手動進樣20 s，羥丙哌嗪濃度2.0×10-5mol/L的條件下，通過改變緩沖液種類，探究了Tris-H3PO4，檸檬酸三鈉-檸檬酸，Tris-檸檬酸以及Na2HPO4-檸檬酸緩沖體系對β-CD-E2整體柱拆分羥丙哌嗪消旋體的洗脫能力。

結果表明，不同的緩沖體系與樣品分子的相互作用力有差異，影響著電滲流的平衡，進而表現出不同的洗脫能力。在pH值4.00條件下，檸檬酸三鈉-檸檬酸緩沖液對羥丙哌嗪的洗脫能力最弱，Tris-檸檬酸緩沖液對樣品分子幾乎不具有對映體選擇性，Tris- H3PO4和Na2HPO4-檸檬酸緩沖液對羥丙哌嗪消旋體都具有一定的手性識別能力，且Na2HPO4-檸檬酸的洗脫能力更強。因此，選用Na2HPO4-檸檬酸作為羥丙哌嗪手性拆分的最佳緩沖體系。

2.2 探究緩沖液pH值對羥丙哌嗪對映體分離的影響

在制備的β-CD-E2整體柱上，選擇Na2HPO4-檸檬酸作為流動相，濃度30 mmol/L，其他條件同2.1，通過改變緩沖液pH值，使其為3.50、4.00、4.50、5.00、5.50、6.00、6.50、7.00，分別考察了pH值對羥丙哌嗪消旋體拆分的影響，部分拆分結果如圖1所示。

圖1 緩沖液pH值對羥丙哌嗪對映體分離的影響
Fig.1 Effect of buffer pH on the enantioseparation of dropropizine

結果表明，緩沖液的pH不僅能夠影響固定相和分析物的表觀電荷，而且影響柱內電滲流(EOF)的平衡，進而影響樣品分子的分離。pH值在3.50～6.00范圍內，β-CD-E2整體柱分離羥丙哌嗪均能達到基線分離。pH值3.50～5.00時，背景緩沖液酸度減小，毛細管內壁EOF增大，樣品分子的遷移時間隨pH值增大而減小；但是pH值5.00～6.00時，毛細管內壁電荷密度隨pH值而增大，影響復合物的解離狀態，導致羥丙哌嗪對映體的分析時間又會逐漸增大；pH值6.00～7.00范圍內，此時電解質接近中性，影響了β-CD-E2固定相對羥丙哌嗪的有效手性識別能力，不利于樣品分子的洗脫。綜合考慮羥丙哌嗪兩對映體的分析時間和洗脫強度，選擇5.00為羥丙哌嗪分離的最佳pH值。

2.3 探究羥丙哌嗪對映體分離的線性范圍

在選擇性優化條件下(檢測波長254 nm，分離電壓-20 kV，Na2HPO4-檸檬酸 pH值5.00，濃度30 mmol/L，手動進樣20 s)，用羥丙哌嗪消旋體標準品配制了不同濃度的溶液，探究了β-CD-E2整體柱分離羥丙哌嗪對映體的線性范圍。結果表明，在9.8×10-6～2.0×10-5mol/L范圍內，羥丙哌嗪濃度與兩對映體峰高、峰面積呈一定的線性相關。

3 結語

本研究利用β-CD-E2作為手性固定相制備的HPCE整體柱拆分了手性藥物羥丙哌嗪，通過對緩沖體系、緩沖液pH值等分離條件的選擇優化，實現了羥丙哌嗪8 min內的快速分離。在檢測波長254 nm，30 mmol/L pH值5.00的Na2HPO4-檸檬酸緩沖液中，樣品濃度2.0×10-5mol/L，電壓-20 kV，手動進樣20 s的最佳分離條件下，羥丙哌嗪對映體的分離度Rs達到40.52，分離結果優于已有文獻[5-6]報道結果。這說明，經過衍生后的β-CD分子內部既存在疏水空腔，同時又帶有羧基、氨基基團。羥丙哌嗪結構中的羥基易與β-CD-E2中氨基、羧基產生較強的靜電相互作用、氫鍵作用以及偶極偶極相互作用從而表現出良好的對映體選擇性。本研究為手性藥物羥丙哌嗪建立了一種新的HPCE分離分析體系。

感謝中央高校基本科研業務費專項資金項目(CZY19037)的資助。