再生紙與原紙中礦物油成分的LC-GC-MS檢測及鑒別

朱麗嫻，林勤保*，陳 勝，鐘懷寧，李 忠，廖 佳

(1.暨南大學 包裝工程研究所，廣東 珠海 519070；2.廣州海關檢驗檢疫技術中心，廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室,食品接觸材料國家重點實驗室，廣東 廣州 510623；3.拱北海關技術中心化學分析實驗室，廣東 珠海 519015)

廢紙回收過程中無法完全清除紙張中所有的污染物(重金屬、印刷油墨等)，因此是否將再生紙用作食品包裝材料一直存在爭議。美國食品和藥品管理局規定滿足一定安全條件的再生纖維可用作食品接觸材料[1]；在歐洲，食品接觸用紙和紙板材料(包括再生纖維制成的紙)必須符合歐盟各成員國的相應法規[2-3]。這些國家和地區建立了限制食品接觸用紙(包括再生紙)中多種有害物質含量的法規[1-4]，此外，我國也建立了相關標準以評估食品接觸用紙的安全性[5]。但再生紙中可能還存在其它未知有害物質，這些物質目前尚無規定或無法檢測。此外，由于紙張的物理化學結構，潛在的遷移物會吸附在纖維素纖維上，甚至可能通過頂空或直接接觸的方式釋放到食品中[6]。

科學研究表明，再生紙食品接觸材料(盒子、紙袋)含有的一系列污染物可能遷移到食品中，例如重金屬(鎘、汞和鉛)、增塑劑和礦物油[7-9]，其中，再生紙中礦物油的研究頗受關注。學者Biedermann等[10]的研究表明，再生紙食品接觸材料是食品受礦物油污染的潛在來源之一；然而其另一項研究使當局陷入了兩難境地：廢紙回收是為了材料的可持續利用，但根據毒理學評估，再生紙中有害物質的遷移通常是不可接受的[11]。

此外，不少學者研究了再生紙和原紙的鑒別方法。Asensio等[12]分析了再生紙和原紙中的揮發性化合物殘留，并對兩者進行分類。Xin等[13]通過傅里葉變換近紅外光譜(FTIR)結合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)，對僅由原生纖維制成的薄紙和含再生、原生兩種纖維制成的薄紙進行分類，該方法無損且省時，但并未研究造成原生纖維和再生纖維之間差異的化學成分。Song等[14]利用氣相色譜-質譜法結合主成分分析成功鑒別了原生和再生聚苯乙烯發泡餐盒，且篩選出差異性物質。

本研究基于PCA、正交偏最小二乘判別分析法(OPLS-DA)，使用在線液相色譜-氣相色譜-質譜(LC-GC-MS)檢測再生紙和原紙的礦物油(MOH)成分，分析再生紙和原紙中飽和烴礦物油(MOSH)和芳香烴礦物油(MOAH)餾分之間的差異，并鑒別出可作為再生紙化學標記物的成分。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

50種紙樣品(24種再生紙、26種原紙)來源于不同的紙張供應商和生產商(廣東、上海等)，紙樣相關信息(克重、厚度、再生漿比例、類型)列于表1。

MOSH餾分內標：十二烷(CAS號112-40-3)、十四烷(CAS號629-59-4)、十六烷(CAS號544-76-3)、二十烷(CAS號112-95-8)、二十四烷(CAS號646-31-1) 、三十五烷(CAS號630-07-9)、四十烷(CAS號4181-95-7)、5-α-膽甾烷(CAS號481-21-0)；MOAH餾分內標：正己基苯(CAS號1077-16-3)、1,3,5-三叔丁基苯(CAS號1460-02-2)、聯苯(CAS號92-52-4)、正壬基苯(CAS號1081-77-2)、苝(CAS號198-55-0)；上述試劑均購自美國Sigma-Aldrich公司。二氯甲烷和正己烷(色譜純，德國Merck公司)，乙醇(HPLC級，荷蘭Biosolve公司)。

(續表1)

R1-R24 are recycled samples,V1-V26 are virgin samples

1.2 儀器與設備

振動篩(SM-30 CONTROL，德國EdmündBuhler GmbH)；離心機(4-15，德國Sigma公司)；LC-GC-Q-Orbitrap-MS系統(德國Thermo Scientific公司)，包括TriPlus RSH自動進樣器、Phoenix 9000 液相色譜、UVIS 20UV微型紫外檢測器、帶預備柱進樣器的TRACE 1310 氣相色譜、轉移開關閥門、電子電離(EI)源和Orbitrap MS。

1.3 實驗方法

1.3.1 紙樣中礦物油的提取參考前人研究方法[15]，稱取1.000 g紙樣于40 mL的帶蓋玻璃小瓶中，加入20 mL萃取溶液(乙醇-正己烷，體積比1∶1)和50 μL內標液(質量濃度：5-α-膽甾烷和苝為500 mg/L，其它MOSH內標為300 mg/L，其它MOAH內標為100 mg/L，溶劑為正己烷)；將混合物在振動篩上以190 r/min振動2 h后，加入20 mL超純水，并以2 000 r/min離心2 min，取出有機相(上層液體)于進樣小瓶中，待上機。每5個紙樣進樣前，對試劑空白進行分析，以識別設備或使用材料中的系統或非系統污染。

1.3.2 LC-GC-Q-Orbitrap-MS分析在線LC分析：流動相A為正己烷，B為二氯甲烷；色譜柱為LiChrospher 60 SI柱(250 mm× 2.0 mm，5 μm，德國Merck公司)。除另有說明外，流動相流速為300 μL/min。梯度洗脫：初始為0%B，0.5 min內升為30%B，保持至3.5 min；在1 min內升為40%B，保持至6.3 min;在6.4 min時將流動相換成100%B(流速增至500 μL/min)，保持至15 min；15.1 min起，流動相改為0%B，保持至35 min(15.1～25 min流速為500 μL/min)[16]，此設置用于重新平衡，并與GC-Q-Orbitrap-MS分析配合使用。進樣量為50 μL。

轉移系統：通過保留間隙技術進行LC-GC轉移[17]，LC分離中，MOSH餾分在保留時間2.0～3.5 min洗脫，而MOAH餾分在保留時間4.0～5.5 min洗脫[17]，本實驗中MOSH和MOAH餾分的轉移時間(LC至GC-MS)分別為2.0～3.5 min和4.0～6.5 min。每個樣品需進樣2次，以分別獲得MOSH和MOAH餾分的原始數據(包括總離子流色譜圖)。LC系統用于分離MOSH和MOAH餾分，當MOSH餾分中不存在芳香烴，MOAH餾分中不存在脂肪烴，說明分離成功。

GC分析：ZB5-MS氣相色譜柱(15 m×0.25 mm，0.25 μm，美國Phenomenex公司)，柱箱溫度為60 ℃(保持10 min)，以20 ℃/min升至350 ℃，保持8 min。載氣為氦氣，流速為1.2 mL/min。

MS分析：使用Tune 2.7和Xcalibur 4.1軟件(德國Thermo Scientific)控制該儀器。EI源(70 eV)，離子源溫度為250 ℃，全掃描模式，質量范圍為m/z50～650。溶劑延遲至9 min。在每批進樣序列之前，以全氟三丁胺作為校正氣體進行調諧、質量校正和泄漏評估。

1.3.3 譜圖收集與數據預處理利用Xcalibur 4.1和TraceFinder 4.0軟件(德國Thermo Scientific)對色譜圖進行處理。通過譜圖解卷積和NIST譜庫(NIST 2014/EPA/NIH)進行化合物篩選鑒定。將LC-GC-Q-Orbitrap-MS原始數據文件(各樣品的MOSH和MOAH餾分文件)導入TraceFinder，并進行峰檢測、解卷積和保留時間對準。解卷積參數參照文獻[18-19]，使用“所有離子”選項和名為“保留時間對齊”的參數(值為10 s)執行色譜峰解卷積，質量提取窗口精確至5 ppm，信噪比(S/N)閾值為10，最小強度信號為2×106，離子重疊窗口為98%。

在TraceFinder中進行未知物篩選后，導出樣品的保留時間、峰面積、未知物表格。由于太多的值可能對數據分析產生影響，因此缺少值估計至關重要。使用“替換為一個小值(原始數據中最小正值的一半)”選項來估計缺失值。采用對數變換使得數據更具可比性[20]。使用Pareto方法對數據集進行縮放，即每個變量的響應均以其中心值減去平均值，然后除以其標準偏差的平方根，對經上述處理后的數據進行多元統計分析。

1.3.4 多元統計分析SIMCA 14.1(Umetrics，瑞典)用于多變量統計分析。PCA是一種常見的探索性數據分析方法，對原始數據中的變量進行線性擬合，生成互不相關的新變量，即主成分，這些主成分可以反映原始變量的絕大部分信息。主成分得分圖中樣品的分布情況可以顯示樣品間的相似性，而載荷圖顯示每個原始變量對主成分的貢獻[6]。

PLS-DA是一種結合偏最小二乘回歸模型和判別分析的方法，可同時分解自變量矩陣X和分類變量Y，并找出自變量X和變量Y間的線性關系。OPLS-DA是將正交信號矯正方法與偏最小二乘法相互結合的判別方法，可過濾自變量矩陣(X)與變量矩陣(Y)無關的信息(即隨機噪聲)，因此OPLS-DA建立的分類模型可以更好地找出不同樣品組間的差異[21]。

變量權重值(VIP)用于衡量變量差異對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力，根據VIP值可篩查再生紙和原紙的差異性物質。本研究的OPLS-DA模型中，選擇VIP值大于1的變量，并對選取變量對應的峰面積進行t檢驗，僅選擇VIP> 1且P<0.05的變量作為潛在標記化合物。

2 結果與討論

2.1 紙樣的MOSH與MOAH餾分中多種化合物的分析

采用LC-GC-Q-Orbitrap-MS技術分析紙樣中MOSH和MOAH組分中的化合物，使用解卷積、NIST庫進行化合物定性。其中，原紙和再生紙中MOAH部分的總離子流圖見圖1，MOAH餾分檢測的物質列于表2，包括單體(即萘、2-甲基萘)和異構體(即二甲基萘同分異構體、三甲基萘同分異構體等)。二異丙基萘同分異構體是無碳復寫紙的一種染料溶劑，主要存在于回收紙漿中[12]。噻吩化合物可能來源于麻袋中的少量精煉油，在大米樣品中也可檢測到噻吩化合物，研究表明二甲基二苯并噻吩和甲基二苯并噻吩可作為礦物油污染的標志物[16,22-23]。另外，化合物2,2′-5,5′-四甲基-1,1′-聯苯和二甲基萘同分異構體作為污染物[24]在本文亦被檢出。芳香族化合物(即二甲基萘)可能來自印刷油墨的染料或溶劑殘留物，或者來自回收纖維的污染物(MOH殘留物，降解產物和燃燒過程，煤焦油的成分)。

MOSH餾分中檢測出具有不同分子量的飽和烴(N-烷烴)。一些正構烷烴可能來源于石蠟，通常作為涂層材料[25]。值得關注的是，再生紙中均含有高濃度的高分子量飽和烷烴(C25～C33)?？赡苁怯捎诘V物油污染，或是再生樣品中含有聚烯烴組分殘留物[24]。

圖1 原紙(A)和再生紙(B)中MOAH部分的總離子流圖Fig.1 Representative total ion chromatograms of MOAH fraction in virgin(A) and recycled(B) papers

表2 紙樣中MOAH餾分檢出的化合物Table 2 Compounds detected in MOAH fraction of paper samples

there is no exact VIP value for alkylated benzenes and dialkylated benzenes

2.2 再生紙與原紙的多元統計分析鑒別

應用多元統計方法研究再生紙和原紙之間的差異性，圖2A和2B顯示了再生紙和原紙樣品中MOSH和MOAH餾分的PCA得分圖。

圖2 再生紙和原紙樣品中MOSH餾分(A)與MOAH餾分(B)的PCA得分圖Fig.2 PCA score plots of MOSH fraction(A) and MOAH fraction(B) in recycled and virgin paper samplesR：recycled paper；V：virgin paper

結果顯示，再生紙和原紙的聚類未明顯分開，導致某些原紙樣品與再生紙聚類。圖2A中，原紙樣品V10、V11與再生紙聚集，可能是由于飽和烴(C25～C33)的污染或在造紙過程中添加或產生這些化合物，因為樣品V10和V11中的飽和烴(C25～C33)含量高于其它原紙(P<0.05)。圖2A和2B中，大部分再生紙樣品形成一個集簇，而再生紙樣品R11和R13有向原紙聚集的趨勢(圖2B)，這是由于R11和R13兩個樣品中的再生漿比例小于其它再生紙樣品(表1)。因此，再生紙與原紙的分類受樣品中再生漿比例和再生漿來源的影響，不同來源、不同比例的再生漿可能會導致重要成分種類、含量的不同，從而影響PCA得分圖中紙樣的聚集情況。使用PCA模型未能很好地區分再生紙和原紙，可能是因為再生漿不同或次要變量成分的干擾。因此，對模型進行了優化，選擇再生紙和原紙樣品(V10、V11異常值除外)MOSH餾分的色譜數據建立OPLS-DA模型，以及所有再生紙和原紙樣品MOAH餾分的色譜數據建立OPLS-DA模型。

PCA是一種無監督模型，在進行主成分分析過程中考慮了所有變量，而監督模型OPLS-DA可以提取變量信息，最大程度地提高群體之間的差異，并有助于識別潛在的差異性物質。使用OPLS-DA模型可以區分再生紙和原紙(圖3A和圖3B)。兩種模型的R2Y(cum)和Q2(cum)值分別為0.990和0.924(圖3A)，0.968和0.838(圖3B)，表明OPLS-DA模型具有良好的適用性和可預測性。通過置換檢驗(Permutation test，n=200)對模型進行驗證。置換檢驗用于評估模型是否存在偽造的風險：驗證思想是將Y觀測值的順序隨機排列而X矩陣保持不變，以比較原始模型與實際模型的擬合優度，將隨機化產生的R2、Q2值與原始積累的R2、Q2值比較。200次置換實驗結果為：R2=(0.0，0.805)，Q2=(0.0，-0.663)(圖3A)；R2=(0.0，0.77)，Q2=(0.0，-0.527)(圖3B)。表明OPLS-DA模型具有較好的可靠性，不存在過擬合現象。

圖3 再生紙和原紙樣品中MOSH餾分(A)與MOAH餾分(B)的OPLS-DA得分圖Fig.3 OPLS-DA score plots of MOSH fraction(A) and MOAH fraction(B) in recycled and virgin paper samplesR：recycled paper；V：virgin paper

2.3 原紙與再生紙的差異性物質

基于差異性化合物的選擇標準，VIP>1且P<0.05，可確定的差異性化合物為：MOAH餾分的二異丙基萘同分異構體、四甲基聯苯同分異構體、二甲基聯苯同分異構體、異丙基聯苯同分異構體，以及MOSH餾分的正構烷烴(C25～C33)；表2中保留時間18.63 min和18.71 min對應的兩個峰未能定性。再生紙中這些物質的含量高，而在原紙中濃度低或未檢出，因此這些化合物具有區分原紙和再生紙的潛力。

2.4 基于再生紙和原紙差異性物質的多變量分析

為評估所選差異性標記物的判別能力，分別基于所選化合物的PCA和OPLS-DA模型對再生紙和原紙的MOSH和MOAH餾分進行鑒別分析。圖4A為基于差異性物質的再生紙和原紙MOSH餾分的PCA得分圖，再生紙和原紙實現了良好分離，前兩個主成分共解釋了95.8%的變量。圖4B為再生紙和原紙MOAH餾分的PCA得分圖，前兩個主成分解釋了90.1%的變量，再生紙和原紙之間的分離效果優于圖2B。但圖4B中再生紙樣品R1、R5、R7、R9、R11和R13傾向于與原紙聚集，主要歸因于這幾種再生紙的回收紙漿來源和比例，檢測結果表明這幾種樣品中差異性物質(二異丙基萘同分異構體、四甲基聯苯同分異構體、二甲基聯苯同分異構體、異丙基聯苯同分異構體)的含量低于其它再生紙樣品。相比之下，再生紙和原紙中MOSH餾分的差異性物質具有更好的區分效果。

圖4 基于差異性物質的再生紙(R)和原紙樣品(V)的PCA得分圖Fig.4 PCA score plots of recycled(R) and virgin(V) paper samples based on differential substancesA：MOSH；B：MOAH

圖5 基于MOH中差異性物質的再生紙和原紙樣品的PCA得分圖Fig.5 PCA score plots of recycled and virgin paper samples based on MOH differential substancesR：recycled paper；V：virgin paper

使用所選差異性化合物建立OPLS-DA模型，兩種模型的R2Y(cum)和Q2(cum)分別為0.916和0.913(MOSH餾分)，0.937和0.913(MOAH餾分)。為驗證模型，進行了置換實驗(n=200)，得R2=(0.0，-0.076 9)，Q2=(0.0，-0.145)(MOSH餾分)；R2=(0.0，0.064)，Q2=(0.0,-0.297)(MOAH餾分)，表明OPLS-DA模型具有良好的適應性和可預測性。

綜合考慮MOSH和MOAH餾分中的差異性物質，建立PCA模型，如圖5(不包括V10和V11)。結果顯示，再生紙和原紙具有更明顯的區分效果；再生紙樣品R1、R5、R7、R9、R11和R13與原紙樣品不再聚集，這6個樣品聚為一小類。表明這些樣品的再生紙漿在MOAH餾分中的差異性化合物(如二異丙基萘同分異構體)含量較低，但MOSH餾分中有足夠的正構烷烴(C25～C33)可將它們與原生紙區分開。

3 結 論

本研究利用LC-GC-MS分析了再生紙和原紙中的礦物油成分，結合化學計量學對再生紙和原紙進行鑒定。由于回收過程中廢紙的污染并不能完全清除，再生紙中含有較多的飽和烴礦物油與芳香烴礦物油。篩選出再生紙和原紙的差異性物質有：MOAH餾分中的二異丙基萘同分異構體、四甲基聯苯同分異構體、二甲基聯苯同分異構體、異丙基聯苯同分異構體，以及MOSH餾分中正構烷烴(C25～C33)。基于再生紙和原紙中MOH的差異性物質建立的PCA模型能夠很好地區分再生紙和原紙。

致謝：感謝瑞士蘇黎世SQTS提供設備儀器的使用便利，以及Thomas Gude博士對本論文的幫助。感謝暨南大學研究生短期出國交流計劃的資助。