茶多酚對羊肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

李立敏　楊豫菘　成立新　姜昕禹　高愛武

摘 要：研究茶多酚對羊肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，將不同添加量（0.00%、0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%）的茶多酚加入到羊肉肌原纖維蛋白中，測定肌原纖維蛋白表面疏水性、乳化性能、保水性、質構特性，觀察羊肉肌原纖維蛋白凝膠微觀結構。結果表明，與對照組相比，茶多酚添加量為0.10%時，羊肉肌原纖維蛋白的表面疏水性最小，疏水基團暴露程度最輕，乳化活性指數達到最大（4.88 m2/g），乳化穩定性指數（86.54%）和保水性（95.22%）均達到最佳;隨著茶多酚添加量的增加，羊肉肌原纖維蛋白凝膠的硬度、咀嚼度、膠著度均顯著上升（P<0.05），彈性、內聚性、回復性整體呈下降趨勢（P<0.05）。結論：添加適量茶多酚可以顯著改善羊肉肌原纖維蛋白的凝膠特性，并且凝膠的微觀結構更加致密、空隙更小、形狀規則且分布均勻;茶多酚與肌原纖維蛋白的非共價結合和共價結合可能會影響蛋白質的功能特性，并且這種作用強度隨著茶多酚添加量的變化而變化。

關鍵詞：羊肉;肌原纖維蛋白;茶多酚;凝膠特性

Abstract： In this paper， the effects of tea polyphenols on the gelation properties of mutton myofibrillar protein （MMP） were investigated. MMP added with different levels of tea polyphenols （0.00%， 0.01%， 0.05%， 0.10%， 0.50% and 1.00%）?（m/m） were determined for surface hydrophobicity， emulsifying properties， water holding capacity and texture characteristics. Besides， the microstructure was observed. The results showed that compared with the control group （without adding tea polyphenols）， addition of 0.10% tea polyphenols decreased the surface hydrophobicity and the exposure of hydrophobic groups to the lowest level， but increased emulsifying activity index （EAI） to the maximum （4.88 m2/g）. MMP added with 0.10% tea polyphenols showed the best emusifying stability （86.54%） and water holding capacity （95.22%）. With increasing concentration of tea polyphenols， the hardness， chewiness and gumminess of myofibrillar protein gels significantly increased （P < 0.05）， while the springiness， cohesiveness and resilience decreased （P < 0.05）. In conclusion， addition of an appropriate amount of tea polyphenols significantly improved the gelation properties of MMP， making the microstructure denser with smaller voids， and more regular in shape with a uniform distribution. Tea polyphenols and MMP can bind both non-covalently and covalently， affecting the functional properties of myofibrillar protein， and this effect varies with the concentration of tea polyphenols.

Keywords： mutton; myofibrillar protein; tea polyphenols; gelation properties

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200131-030

中圖分類號： TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）03-0008-06

肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP）是一種由肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白、肌鈣蛋白及原肌球蛋白等組成的復合體，占肌肉蛋白質的50%～55%[1-2]。

同時，MP也是一類具有重要生物學功能特性的鹽溶性結構蛋白，與乳化性、凝膠性等肉制品加工特性密切相關[3]。過度氧化是導致肉及肉制品品質下降的重要原因，也是目前困擾肉類工業發展的一大技術難題。因此，將蛋白質與脂質氧化程度最小化在產品商業化過程中非常重要[4]。在肉類產品中添加抗氧化劑是各種抗氧化方式中最有效的方法。隨著人們生活水平和食品安全意識的提高，天然抗氧化劑因其安全健康、無毒無害的特點[5]，逐漸成為肉品工業中的研究熱點。根據結構類型，天然抗氧化活性物質主要分為酚酸類、黃酮類、醌類和維生素類等，其中植物多酚在作為肉制品加工天然防腐劑方面已引起廣泛關注[6]。茶多酚具有低廉、安全、高效的特點，在食品工業中具有良好的應用前景。相關研究表明，天然植物提取物能有效抑制肉制品中的脂肪氧化，但是酚類物質及其氧化產物（半醌或醌類）可與蛋白質相互作用，并修飾蛋白質側鏈氨基酸功能基團，進而改變蛋白質結構穩定性、溶解度及其他功能特性[7]。Hasni等[8]研究發現，茶多酚的結合會導致酪蛋白結構展開，表現為α-螺旋和β-折疊的含量減少，同時伴隨著無規則卷曲的含量升高。Jongberg等[9]發現較高添加量的綠茶提取物雖然會提高肉蛋白的氧化穩定性，但是會破壞肉糜的凝膠性能。Rawel等[10]研究發現，酚酸和黃酮與大豆蛋白的共價結合降低了賴氨酸、色氨酸和半胱氨酸的含量，進而可能影響其營養價值。羊肉作為一種內蒙古的特色優質畜肉，具有高蛋白、低脂肪、低膽固醇的特點[11]，但目前仍缺乏關于羊肉MP凝膠特性較為全面、系統的研究。為闡明植物多酚在肉制品中抑制脂肪和蛋白氧化過程的同時對MP凝膠特性的影響，本實驗研究不同茶多酚添加量對羊肉MP凝膠表面疏水性、乳化性能、保水性、質構特性及微觀結構的影響，為凝膠類肉制品的生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊肉后臀部購于呼和浩特東瓦窯批發市場;金龍魚大豆油購于家樂福超市。

茶多酚（純度99%） 麥克林生化科技有限公司;

牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）? ?北京酷來搏科技有限公司;NaCl、KCl、MgCl2、Na2HPO4、NaH2PO4、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、苯甲基磺酰氟、哌嗪-1，4-二乙磺酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、溴酚藍、戊二醛、乙醇、叔丁醇（均為分析純）?國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SQP電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司;DZ-300N小型真空包裝機 上海青葩包裝機械有限公司;BCD-321WDBA電冰箱 青島海爾股份有限公司;ST2100實驗室pH計 奧豪斯儀器（常州）有限公司;FSH-2可調高速均漿機、HH-2數控精密恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司;

QL-866旋渦振蕩器 其林貝爾儀器制造有限公司;TGL-20B高速臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;

U-2910紫外-可見分光光度計、TM4000 Plus新型臺式掃描電子顯微鏡 日本日立株式會社;DGX-9143BC-1電熱恒溫鼓風干燥箱、DZX-6020B真空干燥箱 上海?，攲嶒炘O備有限公司;TA.XT Plus質構儀 英國Stable Micro System公司。

1.3 方法

1.3.1 MP的提取

參考Park[12]和雷娜[13]等的方法并稍作修改。將新鮮羊肉剔除多余脂肪和結締組織，切成1cm×1 cm×1 cm左右小塊，真空包裝，-80 ℃貯存，使用前于0～4 ℃解凍。將完全解凍的肉樣剁碎后，加入肉樣4 倍體積的分離緩沖液A（含20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、150 mmol/L NaCl、25 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2、4 mmol/L EDTA、1 mmol/L苯甲基磺酰氟，pH 7.5），在8 000 r/min勻漿30 s，單層紗布過濾，2 282 r/min離心15 min，棄上清液。將得到的沉淀用分離緩沖液A重復上述步驟3 次，合并沉淀。沉淀經分離緩沖液A洗滌3 次后，用沉淀4 倍體積的分離緩沖液B（含20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L? NaH2PO4、0.1 mol/L KCl，pH 7.5）與分離緩沖液C（含20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、0.1 mol/L NaCl）按上述步驟勻漿離心，重復3 次，最終所得沉淀即為MP。以BSA作為標準蛋白，采用雙縮脲法[14]測定MP含量，得到標準曲線方程為y=0.039 4x+0.006 4 （R2=0.999）。

1.3.2 多酚復合體的制備

用預冷的緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、15 mmol/L哌嗪-1，4-二乙磺酸，pH 6.0）將提取的MP稀釋至30 mg/mL。以MP質量為基準，分別加入0.00%、0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%的茶多酚，隨后用1 mmol/L EDTA終止氧化。

1.3.3 MP乳化性能的測定

參考阮仕艷等[15]的方法測定MP的乳化性能。用0.1 mol/L?pH 6.5磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制質量濃度10 mg/mL的MP溶液。向MP溶液中加入體積比1∶4的大豆油，15 000 r/min勻漿1 min后立即倒入試管中。分別于靜置0、10 min時，在距離試管底0.5 cm處用移液槍吸取50 μL的乳液于5 mL 0.1%的SDS溶液中，充分混勻后于500 nm波長處測定吸光度，分別記為A0和A10。MP的乳化活性指數（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性指數（emulsifying stability index，ESI）分別按式（1）～（2）計算。

式中：ρ為蛋白質量濃度/（mg/mL）;φ為油相體積分數0.20%;A500 nm為乳狀液在500 nm波長處的吸光度;A0、A10分別為乳液在靜置0、10 min時的A500 nm。

1.3.4 MP表面疏水性的測定

參考Chelh等[16]的方法，用20 mmol/L pH 7.0的PBS，配制質量濃度5 mg/mL的MP溶液，取5 mL MP溶液加入1 mL 1 mg/mL溴酚藍溶液，充分混勻，在6 000 r/min離心15 min，收集上清。按上述步驟再次離心后，取上清液用20 mmol/L PBS稀釋10 倍，于595 nm波長處測定光密度（optical density，OD），記為OD樣品。以加入溴酚藍未加MP溶液的PBS為對照，表面疏水性以溴酚藍結合量計，按式（3）計算。

1.3.5 MP凝膠的制備

將40 mg/mL pH 7.0 MP溶液于25 ℃水浴加熱形成凝膠，至凝膠中心溫度達到45 ℃后恒溫30 min，然后以1 ℃/min梯度升溫直至凝膠中心溫度達到90 ℃，恒溫30 min，取出立即放入冰水混合物中冷卻30 min后，4 ℃下保存過夜。

1.3.6 MP凝膠保水性的測定

將MP凝膠取出，室溫靜置30 min。稱取離心管質量（m0，g），放入5 g用濾紙條包裹的凝膠樣品后稱質量（m2，g），6 000 r/min離心10 min，去除多余水分后稱質量（m1，g）。保水性按式（4）計算。

1.3.7 MP凝膠質構特性的測定

將MP凝膠室溫放置30 min后，選用質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）模式，TPA測試參數：探頭型號P/0.5R;測前速率2 mm/s、測試速率1 mm/s、測后速率1 mm/s;位移3 mm;觸發力5 g;觸發類型Auto。

1.3.8 MP凝膠微觀結構的測定

參考Salvador等[17]的方法并稍作修改。將凝膠樣品切塊，用2.5%戊二醛溶液浸泡固定，4 ℃條件下放置24 h。室溫條件下用0.01 mol/L pH 7.4 PBS漂洗10 min，重復3 次，然后分別用體積分數60%、70%、80%、90%乙醇和無水乙醇浸泡20 min梯度脫水，再用叔丁醇浸泡10 min，重復3 次。將樣品于20 ℃、真空度80 Pa條件下干燥12 h，將干燥后的樣品用導電雙面膠固定到樣品臺上，置于掃描電子顯微鏡下觀察，加速電壓20 kV。

1.4 數據處理

結果以平均值±標準差表示。實驗數據用SPSS Statistics 21.0統計軟件進行顯著性差異分析，P<0.05表示差異顯著;采用Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 茶多酚對羊肉MP表面疏水性的影響

小寫字母不同，表示差異顯著（P<0.05）。下同。

由圖1可知：隨著茶多酚添加量的增加，羊肉MP表面疏水性呈先下降后上升的趨勢;當茶多酚添加量0.00%～0.10%時，羊肉MP表面疏水性逐漸降低

（P<0.05）;茶多酚添加量為0.10%時，羊肉MP表面疏水性最小，蛋白質變性程度最低;茶多酚添加量0.50%，羊肉MP表面疏水性又有所增大（P<0.05）;當進一步增加茶多酚添加量至1.00%時，羊肉MP表面疏水性無顯著變化。

蛋白質的表面疏水性能夠反映蛋白質分子內部疏水基團的暴露程度。蛋白質結構展開程度越大，疏水基團暴露越多，蛋白質表面疏水性越大，因此，可用其反映蛋白質的變性程度。蛋白聚集被認為是MP表面疏水性降低的主要原因[18-19]。與對照組（0.00%）相比，茶多酚的添加導致MP表面疏水性顯著減?。≒<0.05），這可能是由于多酚作為一種抗氧化劑通過清除自由基有效減緩了氧化導致的蛋白質降解及變性，從而減少了疏水性氨基酸殘基的暴露，因此，茶多酚處理組MP的表面疏水性均低于對照組。此外，多酚類化合物含有親水性羥基和酚酸羧基，多酚與蛋白質的結合為蛋白質引入了親水性基團，進而降低了蛋白質的表面疏水性[20]。當茶多酚添加量大于0.10%時，MP表面疏水性又有所增加，這可能是由于酚類物質與自由基結合形成醌，醌與蛋白質巰基形成了巰基-醌加成產物;當添加過量的酚類物質時，一部分多酚轉變為醌類物質與MP中氨基等親水性基團共價

結合，從而使MP的表面疏水性增大[21]。這也與Mutilangi等[18]的分析結果一致，即蛋白質經過降解和變性會使其內部分子暴露，從而導致表面疏水性增加。

2.2 茶多酚對羊肉MP乳化性能的影響

由圖2可知，羊肉MP的EAI隨著茶多酚添加量的增加呈先上升后下降趨勢;當茶多酚添加量為0.00%～0.10%時，羊肉MP的EAI逐漸增大（P<0.05）;當茶多酚添加量為0.10%時，MP的EAI最大，達到4.88 m2/g;當茶多酚添加量繼續增加至1.00%時，MP的EAI最小，為1.77 m2/g。

EAI是指蛋白質在促進油-水混合時，單位質量蛋白質能夠穩定的油水界面面積[22]。蛋白質的乳化能力與其溶解度相關，溶解度越高，溶液中能參與乳化的蛋白分子越多，乳化活性越好[23]。結果表明，適量添加茶多酚可以提高羊肉MP的EAI。MP可在脂肪顆粒表面吸附伸展形成界面膜，穩定脂肪顆粒，而MP氧化會引起結構改變，使其形成穩定界面膜的能力降低，導致MP乳化性能降低。多酚作為一種抗氧化劑通過清除自由基有效抑制MP氧化，從而減緩MP乳化性能的降低[9]。但添加過量的酚類物質會使MP發生聚集，在乳化過程中難以伸展并包裹于油滴表面，最終導致難以形成界面膜。因此，過量添加茶多酚導致MP的EAI降低[20]。

ESI是指蛋白質維持油-水混合不分離時對外界條件的抗應變能力，即乳化劑保持乳化物穩定的能力[24]。由圖3可知：當茶多酚添加量為0.00%時MP的ESI最小，為27.82%;隨著茶多酚添加量的增加，羊肉MP的ESI呈先下降后上升的趨勢;當茶多酚添加量為1.00%時MP的ESI達到最大（86.54%），說明此時蛋白質維持油水體系穩定狀態的能力最強;添加0.10%茶多酚的羊肉MP的ESI與未添加時無顯著差異。

蛋白質的乳化能力體現在其既能與水又能與脂肪相互作用，即一定條件下蛋白質溶液乳化脂肪的能力[25-26]。當茶多酚添加量大于0.10%，羊肉MP的ESI顯著上升，可能是由于蛋白質中疏水基團的暴露增加了蛋白質與油脂間的相互作用，促進蛋白質吸附在油脂表面，形成致密穩定的蛋白質膜[27]。另一方面可能是由于多酚物質與MP發生共價結合，提高了界面膜的穩定性和MP的ESI[20]。

2.3 茶多酚對羊肉MP凝膠保水性的影響

由圖4可知：隨著茶多酚添加量的增加，羊肉MP凝膠保水性整體呈上升趨勢;當茶多酚添加量為0.05%時，羊肉MP保水性最小（86.74%）;當茶多酚添加量為1.00%時，保水性最大（95.22%）;當茶多酚添加量為0.10%、0.50%時，羊肉MP保水性相對較好，且2 組間無顯著差異。

保水性是評定肉類品質的重要指標之一，其大小與肉的風味、質構、凝結性及最終產品的多汁性等屬性密切相關[28]。凝膠保水性反映凝膠網絡結構，凝膠結構越細密、均勻，其保水性越好。保水性在MP凝膠網絡結構中形成過程受氫鍵、疏水作用及靜電作用等影響。MP直接和水相互作用產生的毛細現象也與保水性密切相關[29]。由上述實驗結果可知，羊肉MP凝膠保水性隨著茶多酚添加量的增加而顯著增加（P<0.05），可能是由于茶多酚可以抑制蛋白氧化變性，并對蛋白質降解起保護作用，可使凝膠孔隙更加均勻和網絡結構更加緊密，增強蛋白質的水合能力進而提高凝膠的保水性[30]。這與張慧蕓等[31]研究結果一致，即酚類物質的適量添加能夠增強蛋白質的交聯能力，使其網絡結構增強從而保水性更好。

2.4 茶多酚對羊肉MP凝膠質構特性的影響

凝膠硬度是衡量凝膠質構特性的重要指標之一，表示儀器探頭在首次下壓凝膠時壓力達到的最大峰值[28]。由表1可知，隨著茶多酚添加量的增加，羊肉MP凝膠硬度呈顯著上升趨勢（P<0.05）。凝膠彈性是指凝膠在探頭第1次下壓變形后的回彈程度，反映了在外力作用時凝膠變形及去力后的恢復程度。茶多酚添加量為1.00%時，羊肉MP凝膠彈性最?。≒<0.05），而其余各組凝膠彈性差異不顯著[32]。咀嚼度表示咀嚼固體食品所用的能量，而膠著度表示食品在一定作用力下的流動性[28]。隨著茶多酚添加量的增加，MP凝膠的咀嚼度和膠著度呈增大趨勢;當茶多酚添加量為1.00%時，咀嚼度和膠著度均達到最大。內聚性是指形成食品所需形態的內部結合力，回復性是指食品發生形變后在與導致變形同樣的速度、壓力條件下回復的程度[33-34]。羊肉MP的內聚性和回復性隨著茶多酚添加量的增加呈顯著下降趨勢（P<0.05），且均在茶多酚添加量為1.00%時最小。

以上結果表明，隨著茶多酚添加量的增加，羊肉MP凝膠的硬度、咀嚼度和膠著度整體呈顯著上升趨勢（P<0.05）;彈性、內聚性和回復性整體呈下降趨勢，這可能是由于酚類化合物抑制了蛋白質氧化變性，并對蛋白質降解具有保護作用，從而使凝膠維持良好的網狀結構和提高了其質構特性[31]。相關研究表明，酚類物質可以有效提高MP的交聯程度，多酚氧化生成的醌類物質與蛋白質中賴氨酸、蛋氨酸、絲氨酸等氨基酸發生交聯反應，從而增強了蛋白質凝膠強度及穩定性[35-36]。當茶多酚添加量大于0.10%時，羊肉MP凝膠的硬度、咀嚼度、膠著度急劇上升，而彈性、內聚性、回復性急劇下降，可能是由于過量的茶多酚與MP共價結合引起了MP聚集，且一部分多酚屏蔽了MP中的活性基團，不利于三維網狀結構的形成，最終導致MP質構特性變差[37-40]。

2.5 茶多酚對羊肉MP凝膠微觀結構的影響

A～E. 茶多酚添加量分別為0.00%、0.01%、0.05%、0.10%、0.50%、1.00%。

微觀結構表征是研究MP凝膠內部結構與特性的重要手段。由圖5可知：未添加茶多酚的羊肉MP凝膠結構粗糙，質地疏松，存在較多不規則孔洞（圖5A），隨著茶多酚添加量的增加，MP凝膠結構有所改善，網狀結構較致密、空隙較小、形狀規則且分布均勻;這是由于茶多酚添加量的增加，導致更多結合位點與蛋白質交聯形成膠束，從而使凝膠結構更加緊密[31]。另一方面可能是由于茶多酚提高了羊肉MP的膠凝能力，并增強了氧化作用在構建彈性凝膠網絡中的積極作用，多酚被氧化形成的醌類物質會促使MP中的巰基向二硫鍵轉化，而且可以作為交聯劑同時與不同的親核基團共價結合從而使MP發生交聯[38-40]。

綜上所述，適量添加茶多酚可以使羊肉MP形成的凝膠更加致密均勻，這與張慧蕓等[31]的研究結果相似，即添加適量抗氧化酚類物質后形成的MP凝膠結構致密、孔徑較小、形狀規則且均勻，進而使凝膠品質得以改善。與其他處理組相比，當茶多酚添加量為1.00%時，MP凝膠孔徑變大，表面凹凸不平，這表明過量添加茶多酚會破壞MP的凝膠結構，可能是由于過量的多酚物質會與MP共價結合導致蛋白質中游離氨基和巰基數量下降，MP的二級和三級結構遭到破壞，最終發生不良聚集。一部分多酚會屏蔽MP中的巰基、氨基等官能團，從而阻礙蛋白質形成有序的凝膠網狀結構[37-40]。

3 結 論

通過研究不同添加量茶多酚對羊肉MP凝膠特性的影響，發現適量添加茶多酚可有效抑制羊肉MP的交聯和相互作用，進而改善羊肉MP凝膠的穩定性。添加1.00%茶多酚的羊肉MP凝膠的乳化穩定性和保水性最佳;茶多酚添加量為0.50%時，羊肉MP凝膠的整體質構特性最好;當茶多酚添加量為0.10%時，羊肉MP凝膠的表面疏水性最小，蛋白質變性程度最低。因此，添加適量茶多酚可改善羊肉MP凝膠的結構及功能特性。

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