接種植物乳桿菌和蔗糖添加量對發酵香腸品質特性的影響

郭玲玲

摘 要：研究接種植物乳桿菌6003和蔗糖添加量（0.4%和1.5%）對發酵香腸品質的影響。結果表明：接種植物乳桿菌6003，可加速發酵過程中pH值的降低;發酵香腸的硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARs）值和總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量顯著降低（P<0.05）;發酵香腸菌落總數和乳酸菌數在發酵過程中迅速增加（P<0.05），在貯藏期間顯著減少后趨于平穩，且菌落總數和乳酸菌數顯著高于自然發酵香腸（P<0.05）;此外，接種后的發酵香腸具有更高的硬度及總體可接受度評分，顏色無顯著變化。發酵后，隨著貯藏時間的延長，各組發酵香腸的pH值和可滴定酸度無顯著變化，黏聚性、亮度值、紅度值和水分活度顯著降低，黃度值、TBARs值、TVB-N含量、硬度、咀嚼度和膠著度顯著升高;不同添加量蔗糖對發酵香腸相關參數的影響較小。因此，選擇蔗糖添加量0.4%和植物乳桿菌6003接種量7 （lg（CFU/g））的方法生產發酵香腸較為適宜。

關鍵詞：發酵香腸;乳酸菌;植物乳桿菌6003;蔗糖

Abstract： The effects of Lactobacillus plantarum 6003 inoculation and sucrose addition （0.4% and 1.5%） on the quality of fermented sausages were studied. The results showed that this strain could accelerate the decrease of pH value during fermentation. The thiobarbituric acid reactive substances （TBARs） value and total volatile basic nitrogen （TVB-N） content were significantly reduced in the inoculated samples （P < 0.05）. Total bacterial and lactic acid bacteria counts increased rapidly during the fermentation process （P < 0.05）， and decreased significantly from the 4th to the 14th day of storage and then tended to be stable. The total bacterial and lactic acid bacterial counts of the inoculated samples were significantly higher than those of the naturally fermented samples （P < 0.05）. The inoculated samples had higher hardness values and better overall acceptability scores， but showed no difference in color. In addition， with the increase in storage time， the pH value and acidity of each group of sausages did not change， whereas the cohesiveness， brightness value， redness value? and? water activity? decreased significantly. The yellowness value， TBARs value， TVB-N content， hardness， chewiness and stickiness were significantly increased. There were only small effects of different sucrose levels on the investigated parameters. Therefore， addition of 0.4% sucrose and inoculation with 7 （lg （CFU/g）） of Lactobacillus plantarum 6003 were used to produce fermented sausages.

Keywords： fermented sausage; lactic acid bacteria; Lactobacillus plantarum 6003; sucrose

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200106-001

中圖分類號：TS251.65? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）03-0020-07

發酵香腸也被稱為生香腸[1]，傳統發酵香腸制作方法是將豬肉末、脂肪、鹽、糖、胡椒粉和醬油等主要原料充分混合后塞入動物腸衣中，并在約（30±5） ℃條件下自然發酵成熟2～4 d[2-4]。但自然發酵過程中自發產生的部分菌群通常會導致產品品質不一致或不安全[5]，即自然發酵的微生物區系可能由有助于發酵風味和產品質地的有益微生物組成，但也可能包括一些腐敗或致病微生物[6]。

當前，大型工業生產系統生產的產品多在受控條件下生產，以保證產品的一致性，這些受控條件包括溫度、濕度及發酵劑的應用。在肉類發酵中用作發酵劑的微生物通常由一組乳酸菌組成，例如植物乳桿菌、米酒乳桿菌、彎曲乳桿菌和戊糖乳桿菌[7]。肉類發酵過程中的微生物、理化和感官品質變化與乳酸菌活性有關。Sriphochanart等[8]總結發酵香腸發酵過程中的相關變化，包括產生有機酸、pH值降低、肌原纖維和肌漿蛋白水解增加、顏色和發酵風味的產生以及腐敗和致病微生物的減少。Consuelo[9]、Spaziani[10]等指出，發酵香腸發酵過程中的結構變化可能是由于肌原纖維蛋白聚集和凝膠形成，而脫水是影響發酵后樣品質地的主要因素。碳水化合物經常被用作微生物發酵中必需的碳源和能源，從而通過乳酸的積累降低pH值。Consuelo等[11]指出，高代謝性糖（如蔗糖和葡萄糖）的發酵比低代謝性糖（如糊精）的發酵酸化更快，這可能是由于它們具有通過細菌細胞壁轉運的能力。

自然發酵香腸通常是小規模生產，相關報道主要集中在最佳發酵條件和感官品質研究[12]。還有一部分研究發現，使用植物乳桿菌作為香腸發酵劑會產生一些獨特的特性，例如較強的蛋白水解能力、較低的pH值以及對香腸風味形成的影響[13]。此外，接種植物乳桿菌已被證明是減少發酵肉制品中生物胺及細菌素形成的方法[14-15]。植物乳桿菌和其他細菌作為外部發酵劑，可以改善泰國伊桑香腸的發酵過程[8]。本研究探究蔗糖添加量（0.4%和1.5%）和接種植物乳桿菌對發酵香腸品質特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬瘦肉、豬背膘、大蒜粉、食鹽、白胡椒粉、谷氨酸鈉 當地超市。

植物乳桿菌6003 中國輕工業發酵研究所;MRS培養基 美國Merck公司。

1.2 儀器與設備

SCR20B高速離心機 日本Himac公司;MEW713絞肉機、KK500灌腸機 德國Frey公司;LHS-150SC恒溫恒濕培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;205 pH計 德國Testo公司;LabTouch水分活度儀 瑞士Novasina公司;NR-300色差計 日本Nippon Denshoku公司;微量移液器 德國Sartorius公司;U3210紫外分光光度計?日本Hitachi公司;Stomacher 80無菌均質機 英國Seward公司;A20厭氧罐培養系統 美國GeneScience公司;TA-XT2i Plus質構儀 英國Smsta公司;JB-CJ-1500FX無菌操作臺 蘇州佳寶凈化工程設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵劑和發酵香腸的制備

發酵劑培養：將植物乳桿菌6003在MRS肉湯中傳代培養，通過在MRS瓊脂平板上連續劃線培養進行純化;挑選單個菌落轉移至MRS肉湯中，并在30 ℃條件下厭氧培養;溫育48 h后，將菌懸液在4 ℃條件下10 000×g離心10 min，用無菌生理鹽水（0.85 g/100 mL NaCl）洗滌并重懸;使用分光光度計調節OD600 nm使菌懸液中的細菌細胞數為7 （lg（CFU/mL））。

發酵香腸的制備：將豬瘦肉和豬背膘通過10 mm孔徑的絞肉機攪碎，設計制備4 組發酵香腸樣品（表1）。各組基礎配方：豬瘦肉（60%，質量分數，下同）、豬背膘（28%）、大蒜粉（3%）、食鹽（2%）、白胡椒粉（0.6%）、谷氨酸鈉（0.4%）和亞硝酸鈉（0.012%）。肉餡充分攪拌10 min后灌入直徑2.8 cm、長度20 cm的膠原蛋白腸衣中，每組5 根，置于32 ℃和相對濕度75%的恒溫恒濕培養箱中發酵4 d，取出后在4 ℃下貯藏24 d，共28 d。在灌腸后第0（發酵前）、2（發酵期間）、4（發酵結束）、7、14、21、28天（貯藏期）取樣測定。

1.3.2 pH值測定

用pH計配備的肉類專用穿刺電極直接插入腸體測定。

1.3.3 可滴定酸度測定

以酚酞作為指示劑，用0.1 mol/L NaOH滴定乳酸測定可滴定酸度[5]。

1.3.4 水分活度（water activity，aw）測定

使用水活度分析儀測定。

1.3.5 顏色測定

使用色差計測定香腸切片亮度值（L*）、紅度值（a*）和黃度值（b*）。

1.3.6 硫代巴比妥酸反應物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARs）值測定根據Sawitzki等[16]的方法測定。結果以每千克樣品所含丙二醛含量表示。

1.3.7 總揮發性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量測定

根據Yin等[17]的方法，使用微量移液器擴散法測定。

1.3.8 微生物數量測定

菌落總數：取10 g樣品，用90 mL無菌超純水均質90 s，進行梯度稀釋，在37 ℃條件下孵育48 h，使用傾盤法在平板計數瓊脂培養基上對總菌群進行計數。

乳酸菌計數：將樣品均質液的稀釋液倒入MRS瓊脂培養基中，置于厭氧罐37 ℃條件下孵育48 h，進行乳酸菌計數。

1.3.9 質地剖面分析（texture profile analysis，TPA）

使用質構儀在20 ℃條件下測定樣品質構參數，包括硬度、咀嚼度、膠著度、彈性和黏聚性。選用P50探頭，測前速率1.0 mm/s、測定速率1.0 mm/s，測后速率1.0 mm/s，最大負荷2.0 kg，壓縮量50%。

1.3.10 感官評定

在灌腸后第4、14和21天，將各組發酵香腸置于烤箱中（上、下火均為85 ℃）烤制，直至樣品內部溫度達到80 ℃，取出冷卻至約（45±5） ℃，切成薄片（約1.5 cm厚），由感官小組的10 名成員隨機選樣進行感官評價。感官指標包括質地、色澤、風味、酸味和總體可接受度。評分標準采用10 分制，評分越高代表指標屬性越好，品評期間提供溫水漱口。

1.4 數據處理

各項指標均重復測定3 次，所得數據使用SPSS 19.0軟件的常規線性模型進行分析，使用Duncans檢驗分析各組數據的差異顯著性（顯著性水平為0.05）;使用Origin Pro 2018軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 發酵及貯藏過程對香腸pH值和可滴定酸度的影響

由圖1可知，發酵及貯藏過程中，所有處理組發酵香腸pH值迅速下降，尤其是在發酵過程中，隨后穩定下降。灌腸后第0天，發酵香腸pH值為6.22～6.33，各組間無顯著差異;未接種植物乳桿菌6003的發酵香腸（蔗糖添加量分別為0.4%和1.5%）pH值在第2天顯著下降至5.21～5.24，第4天進一步下降至4.53～4.61，然后保持穩定直到第28天;接種后的發酵香腸pH值遵循相似的變化趨勢，但均顯著低于未接種組pH值（P<0.05），即T1組低于C1組，T2組低于C2組。接種組發酵香腸的pH值降低可能是由于乳酸菌的生長，乳酸菌在發酵過程中利用碳水化合物產生有機酸[18]。蔗糖添加量（C1、C2組）對香腸pH值沒有顯著影響。發酵后，所有香腸pH值均低于4.6。

小寫字母不同，表示同一時間、不同處理組差異顯著（P<0.05）;大寫字母不同，表示同一處理組、不同時間差異顯著（P<0.05）。下同。

由圖2可知，發酵及貯藏過程中，發酵香腸可滴定酸度變化趨勢與pH值相反，可滴定酸度在發酵過程中迅速增加，然后略有增加，直到第28天。發酵過程中32 ℃的孵育可能有助于接種的發酵劑培養物的快速生長，并產生更多的酸，以降低樣品pH值;但是，乳酸菌在發酵香腸4 ℃條件下貯藏過程中可能生長或適應情況欠佳，從而導致pH值變化不明顯。接種發酵香腸的可滴定酸度在整個發酵及貯藏期間均高于未接種發酵香腸，而蔗糖添加量并未顯著影響樣品的可滴定酸度。據報道發酵香腸發酵過程中可滴定酸度增加[19]。高酸化率通常伴隨著乳酸菌的快速生長，因此，微生物將能夠在香腸中產生更多有機酸[10，20]。

2.2 發酵及貯藏過程對香腸aw的影響

由圖3可知，在發酵過程中發酵香腸aw快速下降，而在第14天后變化不顯著。不同蔗糖添加量和不同接種發酵劑處理組之間沒有顯著差異。Kalalou等[21]指出，發酵香腸的低aw可能會延長滯后期并縮短不良微生物的對數期，從而降低同一時期的微生物水平。因此，應盡快降低aw以抑制或延緩產品中不良微生物的生長。Roseiro等[22]研究結果表明，在加工過程中添加鹽和脫水導致較高的滲透壓，可能會降低發酵香腸aw。Consuelo等[9]發現，當葡萄糖添加量從0.1%增加到0.5%時，西班牙干香腸aw顯著降低。但是，Qiu Chaoying等[20]報道，糖添加量為3%～12%不會顯著影響廣式發酵香腸aw，這與本研究結果一致。

2.3 發酵及貯藏過程對香腸顏色的影響

由圖4可知，發酵香腸L*在發酵過程中持續增加，在第7天達到最高水平，此后一直下降直至貯藏期結束。發酵及貯藏過程中，所有香腸a*降低，b*升高。在發酵過程中，香腸L*的增加與pH值的快速下降相吻合。根據Visessanguan等[23]的報道，接種植物乳桿菌可加速泰國發酵香腸發酵過程中L*的增加，樣品顏色的變化歸因于產酸、蛋白質變性和亞硝基肌紅蛋白的穩定性，發酵過程中肉蛋白質的酸化會導致肌絲晶格收縮，從而增加肉的光反射。Cavalheiro等[24]研究表明，產酸引起的蛋白質變性和凝結導致發酵肉產品顏色的變化。本研究中各組發酵香腸的L*、a*和b*未觀察到顯著差異。

2.4 發酵及貯藏過程對香腸微生物指標的影響

由圖5～6可知，各組發酵香腸的菌落總數增長模式與乳酸菌增長模式一致。Roig-Sagués等[25]研究表明，乳酸菌與西班牙發酵香腸中需氧嗜溫菌數量之間存在顯著相關性（R2=0.99）。Sriphochanart等[8]指出，乳酸菌在香腸發酵過程中占主導地位。在本研究中，接種組香腸中的初始乳酸菌數量更高，在發酵結束時達到最高水平，為9.0～9.3 （lg（CFU/g）），但未接種組發酵香腸中的乳酸菌數量最高水平為7.5～7.9 （lg（CFU/g））。Lorenzo等[26]指出，發酵結束后乳酸菌數量略有下降，直到貯藏期結束均無明顯變化，這可能是由于可發酵碳水化合物被消耗所致;乳酸菌能夠產生某些抗微生物劑，如有機酸和細菌素，可能會抑制腐敗和病原微生物的生長，使其在發酵產品中具有一定優勢。酸化可能是干發酵香腸中葡萄球菌、微球菌、酵母菌和霉菌生長受到抑制的主要原因。本研究證明植物乳桿菌可被用作香腸發酵劑。

2.5 發酵及貯藏過程對香腸TBARs值和TVB-N含量的影響

由圖7可知，各組發酵香腸TBARs值（脂質氧化指標）在整個發酵及貯藏過程中均逐漸增加。接種組發酵香腸的TBARs值顯著低于未接種組（P<0.05）。接種發酵劑引起發酵肉制品中脂質氧化阻滯，這與Sawitzki等[16]的研究結果一致。Aksu等[27]指出，乳酸菌產生的過氧化氫酶分解過氧化氫，并降低氧化作用。Barrière等[28]指出，木糖葡萄球菌培養物中產生的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶可以抑制脂質氧化過程中揮發性化合物的產生。不同蔗糖添加量發酵香腸TBARs值沒有顯著差異。

由圖8可知，未接種組發酵香腸TVB-N含量從初始的2.8～3.1 mg/100 g增加到發酵后（第4天）的10.5～10.8 mg/100 g，相比之下，接種組發酵香腸TVB-N含量緩慢增加至9.7～9.8 mg/100 g。接種發酵劑后，發酵香腸TVB-N含量增速變緩，該現象在貯藏過程中更為明顯，表明利用乳酸菌發酵可以顯著抑制TVB-N的積累，這與Zaika[29]、Yin[17]等的研究結果一致。接種組發酵香腸TVB-N含量較低，同時微生物數量和pH值也較低。Yin等[17]指出，乳酸菌產生的乳酸和細菌素可抑制腐敗和病原微生物的生長，從而在發酵過程中中和產生的TVB-N。

2.6 發酵及貯藏過程對香腸TPA的影響

由圖9可知，在發酵及貯藏過程中，發酵香腸硬度、咀嚼度和膠著度顯著提高，而黏聚性和彈性則先增加后緩慢降低，直至貯藏期結束，這與前人研究結果一致[20，23]。與未接種組發酵香腸相比，接種組發酵香腸的硬度和膠著度顯著增加（P<0.05），這是由于酸引起的肉蛋白質變性和膠凝。硬度增加可能部分歸因于加工過程中的水分流失[23]。此外，當貯藏結束時，接種組發酵香腸的彈性顯著增加（P<0.05），貯藏期間，C1組發酵香腸的咀嚼度顯著降低（P<0.05）。在香腸生產過程中，糖的添加可使pH值降低至肌原纖維蛋白等電點（約pH 5.1），并增加香腸硬度和咀嚼度[9-10]。在本研究中，添加1.5%蔗糖的發酵香腸具有更高的硬度和咀嚼度。這可能是由于水分含量和pH值降低（添加較高含量的糖類引起）而導致蛋白質構象致密[20]。

2.7 發酵及貯藏過程對香腸感官評分的影響

由表3可知，發酵后，接種組發酵香腸的風味評分比未接種組更高。許多因素都會影響獨特發酵風味的產生，包括產品配方、發酵劑種類和加工條件等[30]。通過微生物和肉類內源酶的作用，碳水化合物、脂質和蛋白質分解，尤其是能夠產生揮發性成分物質的分解，可能有助于樣品發酵風味的形成[31]。T1組樣品風味評分第14～21天明顯下降，T2組樣品風味評分隨貯藏時間的延長明顯下降，這與發酵香腸TBA值和TVB-N含量的升高有關。在發酵及貯藏過程中，發酵香腸質地評分的增加與TPA結果中硬度的增加相吻合，這可能是由于乳酸菌產生酸的作用[24]。第4天和第21天，接種組發酵香腸pH值的明顯降低并沒有影響樣品酸味，這可能與人體味覺的靈敏度有關。蔗糖添加量不同對樣品質量參數的影響較小，這說明0.4%的蔗糖添加量足以滿足發酵香腸的發酵要求。

3 結 論

發酵過程中接種植物乳桿菌6003的發酵香腸具有更高的乳酸菌含量和可滴定酸度、更低的pH值、TBARs值和TVB-N含量，以及更好的質構特性和感官特征，L*、a*、b*和aw無顯著變化。發酵香腸接種7（lg（CFU/g））

植物乳桿菌6003為發酵劑，相比于自然發酵優勢明顯。此外，蔗糖添加量對發酵香腸的各項指標均無顯著影響，蔗糖添加量為0.4%時即可達到較好的效果。發酵后貯藏期間，隨著貯藏時間的延長，各組發酵香腸的pH值和可滴定酸度無顯著變化，黏聚性、L*、a*和aw顯著降低，b*、TBARs值、TVB-N含量、硬度、咀嚼度和膠著度顯著升高，乳酸菌數和菌落總數先降低然后趨于平穩。T1、T2組發酵香腸的總體可接受度評分在第21天時顯著下降。后期將繼續研究不同糖（如蔗糖和葡萄糖）以及其他發酵劑對發酵香腸品質的影響。

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