夏枯草中總黃酮提取工藝的研究

李萬林

摘 要：目的：研究夏枯草中總黃酮的最佳提取工藝。方法：通過正交試驗采用醇提法從夏枯草中提取總黃酮。結果：夏枯草中總黃酮最佳提取方案是：提取時間為50min，乙醇濃度為70%，固液比為1：16。在最佳提取方案下夏枯草中總黃酮的含量為1.2682%。

關鍵詞：夏枯草；總黃酮；提取工藝；正交試驗

引言

夏枯草（Prunella vulgaris）為唇形科夏枯草屬多年生草本植物，其性寒、味苦辛，具有清肝明目、消腫散結等功效，現代臨床多用于治療甲狀腺腫大、淋巴結核、乳腺增生、高血壓、肺結核、急性黃疸性傳染性肝炎等疾病。黃酮類化合物廣泛存在于植物體內，無不良反應，同時具有顯著的清除人體內自由基、抗老化、抗突變、調血脂、血壓等藥理保健功能，是一類極具開發前景的天然抗氧化劑。

黃酮類化合物是指通過中央三碳鏈相互連接而成的一系列化合物的統稱 ，包括黃酮、黃烷酮、雙黃酮及其甙等化合物。黃酮類物質廣泛存在于動物牧草飼料、一些中草藥及我們日常食用的豆類、某些谷類、水果和蔬菜等植物性食物中。近年，對其功能研究表明：動物體內、外試驗證明，黃酮類物質具有提高動物的免疫機能，促進動物的繁殖、生長等功能，且具有劑量小、見效快，毒性低等優點。因此，是一種具有廣闊開發前景的新型飼料添加劑。

不僅如此，夏枯草在我國種植廣泛，資源極其豐富，是人們十分喜愛的一種飲品。目前夏枯草的活性成分研究主要集中在多糖類成分，黃酮類成分的研究較少，本文以夏枯草中總黃酮為研究對象，考察了夏枯草中總黃酮的提取工藝，旨在為夏枯草中提取黃酮類物質以及在飼料領域中的綜合開發應用提供理論參考。

1 實驗

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料與試劑

市購夏枯草，于60℃下烘干，粉碎后過60目篩，備用。蘆丁標準品（>98%，上海源葉生物科技有限公司）；其余無水乙醇、無水三氯化鋁、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純。

1.1.2 儀器

722-E型紫外分光光度計（上海精密儀器科學有限公司）、GR-200型單盤電子分析天平（日本AND）、SHZ-3型水循環真空泵（河南鞏義市杜甫儀器廠）、DOB20005型電熱干燥箱（中國重慶銀河試驗儀器有限公司）、JJ-2型組織搗碎機（金壇市城西春蘭實驗儀器廠）等。

1.2 實驗方法

1.2.1 總黃酮的提取工藝流程

夏枯草粉末→乙醇提取→提取液過濾→離心→上清液定容→測量吸光度→計算總黃酮含量

1.2.2 實驗步驟

將10.0 g夏枯草粉末與一定體積濃度的乙醇（50%、65%、70%、75%、90%）按一定料液比例（m/mL，1：8、1：12、1：16、1：20、1：24）混合，在一定溫度下（40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）提取一定時間（20min、30min、40min、50min、60min）。

提取液真空抽濾，濾液用65%乙醇溶液定容至100mL容量瓶中。然后準確量取適量提取液于50mL容量瓶中，加5% NaNO2 1.5mL，搖勻，放置6分鐘；加10% Al（NO3）3 1.5mL，搖勻，放置6分鐘；加4% NaOH 20mL，加65%乙醇至刻度，搖勻，放置10分鐘。最后用分光光度計在510nm波長下測定吸光度值，并計算總黃酮含量。

1.2.3 標準曲線制作

準確稱取干燥至恒重的蘆丁20.30mg，加適量75%乙醇，微熱使之溶解。自然冷卻后，置100mL量瓶中定容，得蘆丁乙醇溶液。吸取蘆丁乙醇溶液0.0mL、2.0mL、4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL，分別置50mL量瓶中，加5% NaNO2 1.5mL，搖勻，放置6分鐘，加10% Al（NO3）31.5mL，搖勻，放置6分鐘，加4% NaOH 20mL再加75%乙醇至刻度，搖勻，放置13分鐘。最后用分光光度計在最510nm波長下測定吸光度值。結果如表1所示：

對上表的數據做回歸處理得回歸方程：

A=7.3384C+0.2575 R2=0.9984

1.2.4 總黃酮含量的測定：

配取定量試液按照實驗步驟繪制標準曲線，用分光光度計在510 nm處測定吸光度，按回歸方程計算樣品液中總黃酮的提取率（mg/g）。

2 實驗結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 固液比對夏枯草總黃酮含量的影響

在提取溫度70℃和提取時間50min的條件下，用80%的乙醇按實驗步驟分別處理固液比為1：8、1：12、1：16、1：20、1：24，結果如表2所示：

實驗結果表明，隨著固液比升高，總黃酮提取率呈上升趨勢。當固液比大于1∶16之后，總黃酮提取率增加不大，綜合考慮提取成本。固液比1∶16的提取效果較為適宜。隨著料液比的增大，夏枯草中總黃酮提取率在增大，因為此時單位質量夏枯草周圍的乙醇含量增大，傳質速率提高，提取率變大；但是當料液比大于1∶16后，總黃酮的提取率趨緩，這是由于夏枯草中總黃酮已基本浸出，再增大料液比反而增加了生產成本，故料液比控制在1∶16為宜。

2.1.2 提取時間對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取溫度70℃和固液比1∶16的條件下，用80%的乙醇按實驗步驟分別處理時間為：20min、30min、40min、50min、60min，結果如表3所示：

實驗結果表明，隨著提取時間的延長，夏枯草中總黃酮提取率顯著增大，當提取時間大于50min時，總黃酮提取率反而下降，這是由于夏枯草中總黃酮已基本浸出，再延長提取時間反而可能會使總黃酮分解，導致提取率的降低，出于實驗的可操作性考慮，提取時間控制在50min為宜。

2.1.3 提取溫度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間50min和固液比1：16的條件下，用80%的乙醇按實驗步驟分別處理時間為：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，結果如表4所示：

實驗結果表明，在40℃～70℃之間隨著溫度的升高，總黃酮提取率隨著增大，這是由于在較低的溫度范圍內，隨著溫度的升高，分子運動加快，細胞間的摩擦作用使得細胞破裂，夏枯草中總黃酮的溶解及擴散速度加快，故提取率顯著提高；但當溫度過高時，總黃酮會加速分解，使得提取率降低，故最佳提取溫度為70℃。

2.1.4 乙醇濃度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間為50min、提取溫度為70℃和固液比為1：16的條件按實驗步驟分別處理乙醇濃度為：50%、65%、70%、75%、90%，結果如表5所示：

實驗結果表明，在乙醇體積分數為50%～70%之間，夏枯草中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，在乙醇體積分數為70%時總黃酮的提取率最高，可能是因為夏枯草中總黃酮的極性更接近體積分數為70%的乙醇的極性；隨著乙醇體積分數的進一步增大，總黃酮提取率反而降低，可能是由于一些雜質也溶于了乙醇，導致總黃酮濃度的進一步增大，故乙醇體積分數控制在70%為宜。

2.2 正交實驗

根據單因素實驗的結果，以影響夏枯草總黃酮提取率的提取時間（A）、乙醇濃度（B）、固液比（C）為三個實驗因子，以夏枯草總黃酮提取率為目標，做三因素三水平正交設計，共計9個實驗點，以確定夏枯草中總黃酮提取的最優工藝組合。確定每個因素的3個水平為：提取時間40min、50min、60min，乙醇濃度65%、70%、75%，固液比1：12、1：16、1：20，采用L9（33）正交表進行正交實驗，實驗設計及結果如表6和表7所示。

根據極差R值可知各因素對夏枯草中總黃酮提取得率的影響順序為：B >C>A，即乙醇濃度對總黃酮提取得率影響最大，其次是固液比，影響最小的是提取時間。最終得出夏枯草中總黃酮的最佳提取條件是：A2B2C2，提取時間為 50min，乙醇濃度為70%，固液比為1：16。

3 結論

本實驗應用乙醇溶劑熱提取法提取夏枯草中的功能成分黃酮類化合物，通過正交實驗以提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比四方面的單因素實驗對影響總黃酮提取得率的因素進行了研究，實驗結果表明，以乙醇為溶劑來提取夏枯草中的黃酮類化合物時，最佳的工藝條件為：以體積分數為70%的乙醇、提取時間50min、固液比為1：16，按照正交試驗的最佳工藝條件進行驗證試驗，平行試驗3次，取其平均值，得在最佳提取條件下總黃酮提取率的平均值為1.2682%。

參考文獻（略）

2.1.3 提取溫度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間50min和固液比1：16的條件下，用80%的乙醇按實驗步驟分別處理時間為：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，結果如表4所示：

實驗結果表明，在40℃～70℃之間隨著溫度的升高，總黃酮提取率隨著增大，這是由于在較低的溫度范圍內，隨著溫度的升高，分子運動加快，細胞間的摩擦作用使得細胞破裂，夏枯草中總黃酮的溶解及擴散速度加快，故提取率顯著提高；但當溫度過高時，總黃酮會加速分解，使得提取率降低，故最佳提取溫度為70℃。

2.1.4 乙醇濃度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間為50min、提取溫度為70℃和固液比為1：16的條件按實驗步驟分別處理乙醇濃度為：50%、65%、70%、75%、90%，結果如表5所示：

實驗結果表明，在乙醇體積分數為50%～70%之間，夏枯草中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，在乙醇體積分數為70%時總黃酮的提取率最高，可能是因為夏枯草中總黃酮的極性更接近體積分數為70%的乙醇的極性；隨著乙醇體積分數的進一步增大，總黃酮提取率反而降低，可能是由于一些雜質也溶于了乙醇，導致總黃酮濃度的進一步增大，故乙醇體積分數控制在70%為宜。

2.2 正交實驗

根據單因素實驗的結果，以影響夏枯草總黃酮提取率的提取時間（A）、乙醇濃度（B）、固液比（C）為三個實驗因子，以夏枯草總黃酮提取率為目標，做三因素三水平正交設計，共計9個實驗點，以確定夏枯草中總黃酮提取的最優工藝組合。確定每個因素的3個水平為：提取時間40min、50min、60min，乙醇濃度65%、70%、75%，固液比1：12、1：16、1：20，采用L9（33）正交表進行正交實驗，實驗設計及結果如表6和表7所示。

根據極差R值可知各因素對夏枯草中總黃酮提取得率的影響順序為：B >C>A，即乙醇濃度對總黃酮提取得率影響最大，其次是固液比，影響最小的是提取時間。最終得出夏枯草中總黃酮的最佳提取條件是：A2B2C2，提取時間為 50min，乙醇濃度為70%，固液比為1：16。

3 結論

本實驗應用乙醇溶劑熱提取法提取夏枯草中的功能成分黃酮類化合物，通過正交實驗以提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比四方面的單因素實驗對影響總黃酮提取得率的因素進行了研究，實驗結果表明，以乙醇為溶劑來提取夏枯草中的黃酮類化合物時，最佳的工藝條件為：以體積分數為70%的乙醇、提取時間50min、固液比為1：16，按照正交試驗的最佳工藝條件進行驗證試驗，平行試驗3次，取其平均值，得在最佳提取條件下總黃酮提取率的平均值為1.2682%。

參考文獻（略）

2.1.3 提取溫度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間50min和固液比1：16的條件下，用80%的乙醇按實驗步驟分別處理時間為：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，結果如表4所示：

實驗結果表明，在40℃～70℃之間隨著溫度的升高，總黃酮提取率隨著增大，這是由于在較低的溫度范圍內，隨著溫度的升高，分子運動加快，細胞間的摩擦作用使得細胞破裂，夏枯草中總黃酮的溶解及擴散速度加快，故提取率顯著提高；但當溫度過高時，總黃酮會加速分解，使得提取率降低，故最佳提取溫度為70℃。

2.1.4 乙醇濃度對夏枯草總黃酮提取率的影響

在提取時間為50min、提取溫度為70℃和固液比為1：16的條件按實驗步驟分別處理乙醇濃度為：50%、65%、70%、75%、90%，結果如表5所示：

實驗結果表明，在乙醇體積分數為50%～70%之間，夏枯草中總黃酮的提取率隨著乙醇濃度的升高而增大，在乙醇體積分數為70%時總黃酮的提取率最高，可能是因為夏枯草中總黃酮的極性更接近體積分數為70%的乙醇的極性；隨著乙醇體積分數的進一步增大，總黃酮提取率反而降低，可能是由于一些雜質也溶于了乙醇，導致總黃酮濃度的進一步增大，故乙醇體積分數控制在70%為宜。

2.2 正交實驗

根據單因素實驗的結果，以影響夏枯草總黃酮提取率的提取時間（A）、乙醇濃度（B）、固液比（C）為三個實驗因子，以夏枯草總黃酮提取率為目標，做三因素三水平正交設計，共計9個實驗點，以確定夏枯草中總黃酮提取的最優工藝組合。確定每個因素的3個水平為：提取時間40min、50min、60min，乙醇濃度65%、70%、75%，固液比1：12、1：16、1：20，采用L9（33）正交表進行正交實驗，實驗設計及結果如表6和表7所示。

根據極差R值可知各因素對夏枯草中總黃酮提取得率的影響順序為：B >C>A，即乙醇濃度對總黃酮提取得率影響最大，其次是固液比，影響最小的是提取時間。最終得出夏枯草中總黃酮的最佳提取條件是：A2B2C2，提取時間為 50min，乙醇濃度為70%，固液比為1：16。

3 結論

本實驗應用乙醇溶劑熱提取法提取夏枯草中的功能成分黃酮類化合物，通過正交實驗以提取時間、提取溫度、乙醇濃度、固液比四方面的單因素實驗對影響總黃酮提取得率的因素進行了研究，實驗結果表明，以乙醇為溶劑來提取夏枯草中的黃酮類化合物時，最佳的工藝條件為：以體積分數為70%的乙醇、提取時間50min、固液比為1：16，按照正交試驗的最佳工藝條件進行驗證試驗，平行試驗3次，取其平均值，得在最佳提取條件下總黃酮提取率的平均值為1.2682%。

參考文獻（略）