A型肉毒毒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β/Smad通路和ERK通路表達的影響

尚念勝 牛燕英

[摘要]目的：探討A型肉毒毒素對人瘢痕疙瘩成纖維細胞（Human keloid fibroblasts，HKF）生物學行為和TGF-β/Smad信號通路和ERK信號通路表達的影響。方法：在HKF培養過程中加入A型肉毒毒素進行干擾，觀察A型肉毒毒素對瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β/Smad通路和ERK通路相關分子的變化及細胞增殖、侵襲、凋亡情況。結果：A型肉毒毒素可以抑制HKF增殖、遷移和侵襲，促進凋亡，并且明顯抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表達水平，上調IFN-γ、TGF-β3基因的表達水平。上調Smad7基因和蛋白的表達，下調VEGF基因表達，明顯抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平，并且抑制P-ERK1/2蛋白表達。以上生物學變化均且呈藥物濃度依賴性。結論：A型肉毒毒素可抑制HKF的增殖、侵襲、血管生成和膠原積累，這些效應與TGF-β/Smad和ERK1/2信號通路有關。

[關鍵詞]瘢痕疙瘩;A型肉毒毒素;人瘢痕疙瘩成纖維細胞;ERK信號通路;TGF-β/Smad通路;細胞增殖;細胞遷移;細胞侵襲

[中圖分類號]R619+.6 ? ?[文獻標志碼]A ? ?[文章編號]1008-6455（2020）05-0104-06

Abstract： Objective ?To investigate the effects of botulinum toxin type A on the biological behavior of human keloid fibroblasts （HKF） and the expression of TGF-β/Smad and ERK signaling pathways. Methods ?Botulinum toxin type A was added to HKF culture to interfere with the changes of TGF-β/Smad pathway and ERK pathway related molecules， cell proliferation， invasion and apoptosis of keloid fibroblasts. Results ?Botulinum toxin type A could inhibit the proliferation， migration and invasion of HKF， promote apoptosis， and significantly inhibit the expression levels of collagen type Ⅰ， collagen type Ⅲ， fibronectin， α-SMA and CTGF genes， and up-regulate the expression levels of IFN-γ and TGF-β3 genes. Botulinum toxin type A can significantly up-regulate the expression of Smad7 gene and protein in TGF-β/Smad pathway， down-regulate the expression of VEGF gene， significantly inhibit the expression of p-Smad2 and p-Smad3 protein， and inhibit the expression of P-ERK1/2 protein. The above biological changes were dose-dependent. Conclusion ?Botulinum toxin ?type A can inhibit the proliferation， invasion， angiogenesis and collagen accumulation of HKF in a dose-dependent manner. These effects are related to TGF-β/Smad and ERK1/2 signaling pathways.

Key words： keloid; botulinum toxin type A; human keloid fibroblasts; ERK signaling pathway; TGF-β/Smad pathway; cell proliferation; cell migration; cell invasion

瘢痕疙瘩是整形外科難治性疾病之一，既影響了皮膚外觀和功能，也給患者帶來極大痛苦[1]。目前，瘢痕疙瘩的發病機制尚未明了，臨床上多采用局部藥物治療、手術和激光治療等綜合措施，但是效果不甚理想[2]。A型肉毒毒素治療增生性瘢痕的效果較好，但是其治療機制尚未明確，可能與抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的增殖和促進凋亡有關[3-5]。TGF-β/Smad信號通路可參與瘢痕疙瘩的形成[6]。細胞外信號調節激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）是傳遞絲裂原信號的信號轉導蛋白，可參與細胞增殖與分化、細胞形態維持、細胞骨架的構建等多種生物學反應[7]。ERK信號通路同樣在調節瘢痕疙瘩成纖維細胞的生物學行為中有重要作用[8]。本研究以人瘢痕疙瘩成纖維細胞（Human keloid fibroblasts，HKF）為研究對象，檢測了A型肉毒毒素干預后HKF的增殖、凋亡、遷移和TGF-β/Smad信號通路及ERK信號通路表達水平的變化，旨在探討A型肉毒毒素治療瘢痕疙瘩的機制。

1 ?材料和方法

1.1 細胞及培養：HKF購于上海雅吉生物科技有限公司，含10%胎牛血清的DMEM-1640培養液（上海恒斐生物科技有限公司）進行培養，條件為37℃、5% CO2。

1.2 方法

1.2.1 細胞活力測定：細胞計數試劑盒購于上海新睿生物有限公司。HKF（1×104個/ml）接種于96孔板中，培養24h。不同劑量（1×106/ml細胞分別加入肉毒毒素0μl、1.0μl和2.5μl）A型肉毒毒素（使用時稀釋為50U/ml，蘭州生物制品研究所）干預1d、2d、3d、4d和5d后，每孔加入10μl CCK-8，培養2.5h。微孔板閱讀器（芬蘭雷勃公司）450nm處讀取吸光度。

1.2.2 流式細胞術檢測凋亡：Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購于艾美捷科技有限公司。HKF（2×105個/孔）接種于6孔板中，培養24h。不同劑量A型肉毒毒素干預72h后，300×g室溫離心5min，收集各孔HKF，冷PBS洗滌兩次。將細胞重懸在500μl緩沖液中，加入10μl碘化丙啶，反應10min;冰浴冷卻終止反應。流式細胞儀（美國BD公司）檢測細胞凋亡情況，CellQuest軟件定量分析細胞凋亡率。

1.2.3 RT-PCR法檢測mRNA相對表達量：Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄后進行RT-PCR檢測。引物序列來自上海生物工程有限公司。RT-PCR反應條件為：預變性95℃ 30s;95℃ 5s，60℃ 30s，40個循環。以GAPDH為內參，-△△CT法計算mRNA相對表達量。

1.2.4 細胞劃痕試驗：HKF接種于6孔板中，當細胞融合100%時，移液槍頭沿板底劃一字型劃痕，換無血清培養基培養24h、48h。顯微鏡下拍攝圖片，Image Pro Plus 6.0軟件分析細胞遷移情況。細胞遷移率=（1-測量時劃痕寬度/初始劃痕寬度）×100%。

1.2.5 免疫熒光染色法檢測I型膠原、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）和Ki-67：HKF接種于6孔板中，培養24h。A型肉毒毒素干預72h后，4%多聚甲醛固定，4℃過夜。0.3% Triton X-100室溫處理1h，山羊血清（美國Sigma）37℃阻斷非特異性結合位點30min。HKF與兔抗人抗體4℃孵育過夜，抗體稀釋濃度為I型膠原（1：500）、α-SMA（1：100）和Ki-67（1：1 000）（美國ABCAM）。加入熒光山羊抗兔抗體（美國Sigma）孵育1h，DAPI染色，熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）拍攝圖像。

1.2.6 Western-bolt檢測蛋白表達水平：取細胞上清液，加入蛋白裂解液，冰上裂解25min，15 000r/min離心15min。加入SDS緩沖液煮沸5min使蛋白變性。經SDS-PAGE后蛋白轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1h，孵育一抗，4℃過夜，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5min。室溫孵育二抗2h，棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5min。ECL顯色，以GAPDH作為內參，計算目標蛋白條帶與GAPDH灰度比值。

1.2.7 Transwell小室檢測細胞侵襲能力：用無血清培養液將HKF調整至2×105個/ml，取0.2ml到Transwell小室（上海生工），室下加入10%胎牛血清0.5ml，培養4h。待貼壁后更換上室培養液，培養24h，拭去小室濾膜上的細胞，PBS洗滌，甲醛固定15min，HE染色，統計膜背面侵襲的細胞數。細胞侵襲能力=穿膜細胞穿過濾膜的細胞數/相應孔細胞數。

1.3 統計學分析：采用SPSS 19.0統計學軟件進行數據分析。正態計量數據用“x?±s”表示，組間比較采用單因素方差分析;重復測量資料采用重復測量資料方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 ?結果

2.1 A型肉毒毒素抑制HKF增殖：CCK-8檢測結果表明，1.0μl組和2.5μl組均可抑制HKF增殖能力，且2.5μl組較1.0μl組強，差異有統計學意義（P<0.05），見圖1A。免疫熒光染色結果表明，1.0μl組和2.5μl組Ki-67表達水平明顯低于0μl組，且2.5μl組較1.0μl組水平更低，差異均有統計學意義（P<0.05），見圖1B、D。用1.0μl和2.5μl A型肉毒毒素干預后，HKF密度明顯降低，且2.5μl組更低（P<0.05），見圖1C。說明A型肉毒毒素可以明顯抑制HKF增殖，且濃度越高，抑制作用越強。

2.2 A型肉毒毒素促進HKF凋亡：流式細胞術檢測結果，A型肉毒毒素可明顯促進HKF凋亡，且藥物濃度越高促進凋亡的能力越強（P<0.05）。見圖2。

2.3 A型肉毒毒素減少膠原蛋白和細胞外基質積累：A型肉毒毒素可以明顯抑制Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、纖維連接蛋白、α-SMA和CTGF基因的表達，上調IFN-γ、TGF-β3基因的表達，且2.5μl的作用比1.0μl強（P<0.05），見圖3A。免疫熒光檢測結果顯示，A型肉毒毒素干預后表達水平下降，且2.5μl組最為明顯（見圖3B）。Western-blot法檢測結果表明，2.5μl組Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白表達明顯低于1.0μl組（見圖3C）。

2.4 A型肉毒毒素抑制HKF遷移：A型肉毒毒素可以抑制HKF遷移，且藥物濃度越高，抑制作用越強（P<0.05）。見圖4。

2.5 A型肉毒毒素抑制HKF侵襲：A型肉毒毒素可以明顯抑制HKF侵襲，且藥物濃度越高，抑制作用越強（P<0.05），見圖5A、C。RT-PCR檢測發現，A型肉毒毒素可以抑制MMP-1和MMP-3的mRNA表達水平，且2.5μl組比1.0μl更低（P<0.05），見圖5B。

2.6 A型肉毒毒素對TGF-β/Smad通路和ERK通路的影響：A型肉毒毒素可以抑制TGF-β1、VEGF、PAI-1基因表達，上調Smad7，且呈藥物濃度依賴性。Western-blot檢測結果表明，A型肉毒毒素可以明顯抑制p-Smad2和p-Smad3蛋白表達水平，并且抑制了p-ERK1/2蛋白表達，Smad7蛋白表達上調，三組Smad 2/3總蛋白和T-ERK 1/2總蛋白的比較差異無統計學意義（P>0.05）。見圖6。