高壓氧對腦缺血再灌注損傷后Cx37表達及血腦屏障的影響

佟雪，張倩茹，趙紅，陳學新

高壓氧(hyperbaric oxygen, HBO)是當前腦科無創性治療的新興手段，通過采用壓力較強的氧氣予以治療，迅速提升患者體內血氧含量，起到對患者腦部組織細胞血液及氧氣再灌注的效果，以防止長時間缺氧狀態下患者腦部神經進一步損傷，其應用效果較好[1-2]。但其在腦缺血再灌注(cerebral ischemia/reperfusion, CIR)損傷后對血腦屏障(blood-brain barrier , BBB)保護性作用的分子機制尚不明確。BBB的改變是CIR損傷后主要的病理生理變化。BBB是由四個部分組成：血管內皮細胞及其間緊密連接、內皮基膜、星形膠質細胞終足和周細胞[3]。縫隙連接蛋白37(Connexin37,Cx37)是構成細胞間縫隙連接(gap junction, GJ)通道最主要的膜蛋白，表達于腦血管內皮細胞上，是構成BBB的精細結構，對維持BBB內環境穩定有重要意義。CIR損傷后BBB的通透性的改變與神經細胞上GJ通道的異常變化密切相關[4]。本研究通過觀察CIR損傷后高壓氧治療后腦組織Cx37mRNA及蛋白的變化，進一步闡明高壓氧降低BBB通透性的作用機理，為臨床上應用HBO治療腦血管疾病提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選取成年健康雄性Wistar大鼠240只, 3～4月齡，體質量為(250±30)g(由中國醫科大學動物部提供)。240只大鼠隨機分為假手術組、模型組、模型+HBO組、HBO組(假手術組只進行了HBO處理)各60只。

1.2 方法 腦缺血再灌注動物模型的復制[5]：采用大腦中動脈線栓法，大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉,麻醉后固定于腦立體定位儀上，于顱內置入激光多普勒血流儀探頭以監測右側大腦中動脈供血區組織內血流量情況；在右側頸部切開,暴露右側頸總動脈,分離迷走神經。結扎翼腭動脈和頸外動脈, 將末端圓鈍的420尼龍絲線依次通過頸外動脈和頸內動脈小心插至大腦前交通動脈,插入約118～210cm, 阻塞右側大腦中動脈,120min后,拔出尼龍線形成再灌注。對照組為假手術組,僅結扎頸外動脈,造成與實驗組同樣的手術損傷。實驗鼠的高壓氧處理：HBO組與模型+HBO組于術后1h、9h、21h、45h、69h進入HBO艙內(動物氧氣加壓艙，產地：北京，型號：GB12130-1995，艙的直徑：600×600×900mm)，待動物進艙后，先用純氧洗艙10min，使艙內O2濃度>90%，加壓速率為0.0125Mpa/min，加壓至0.25Mpa，在高壓氧狀態下停留60min，其間用純氧通氣10min。停留畢，以20min勻速減至常壓。假手術組與模型組亦置于艙內，模擬除壓力，氧濃度外的類同模型+HBO組和HBO組的其它處理過程和環境條件。

1.3 檢測指標 腦組織伊文思蘭(Evans Blue, EB)測定：參考Hawkins[6]用甲酰胺測定皮膚EB含量的方法加以改進。大鼠于再灌注后0h、4h、12h、24h、48h、72h檢測腦組織EB的含量。在處死動物前1h經尾靜脈注入2%EB生理鹽水(1ml/kg),在摘取腦組織前20min經心臟灌注生理鹽水而直至流出清亮的液體為準。處死大鼠冰盤取腦組織用電子天平精確稱其濕重后，投入中試管中，分別加入3ml甲酰胺，加蓋后于45℃水浴箱孵育48h輕輕搖勻，離心15min(3000r/min),取上清液在分光光度計比色(r=623nm)。Western Blot檢測CIR損傷后腦組織Cx37蛋白的表達：按照說明書進行組織總蛋白的提取及定量，取含同等蛋白量(50ug)樣本稀釋至等體積，和2×sample buffer(100mmol/L Tris-HCL ,200 mmol/L DTT,4% SDS,0.2%溴酚藍，20% 甘油)等體積混勻，100℃水浴 5mim,趁熱加樣，每孔10ul，進行電泳。電泳后凝膠用于考馬斯亮藍染色和電轉移。電轉移：SDS-聚丙烯酰胺膠卸下，浸入轉移液中，在轉移液中平衡10min,然后加于轉模裝置中，100mA×60min轉模。電泳及電轉后，將膜取出，加Cx37一抗(CellSignaling Technology 公司，Cx37兔抗濃度為1∶1000)及GADPH一抗(武漢博士德公司，GADPH鼠抗濃度為1∶1000)，4℃冰箱中過夜。取出膜，TBST 漂洗，加偶聯辣根過氧化物酶(HRP)的二抗(武漢博士德公司)，用封閉液稀釋，抗兔二抗濃度為1∶5000，抗鼠二抗濃度為1∶2000，室溫下作用2h，用ImageJ圖像處理軟件分析目的條帶的凈光密度值。 RT-PCR檢測CIR損傷后腦組織Cx37mRNA的表達：組織總RNA提取和反轉錄反應：采用異硫氰酸胍一步法，取上述各組腦組織，加入預冷的Trizol變性液1ml,在玻璃勻漿器中冰上勻漿，靜置5min，其余步驟嚴格按Trizol提取液說明書進行。所得總RNA溶解于無RNA酶抑制劑水中。取部分總RNA用紫外分光光度計測定RNA樣品，在波長260、280 nm 處的吸光度(A)的比值以檢測其純度，當比值在1.8～2.0表明RNA純度較高。用凝膠電泳檢查其完整性，其余-800C保存待進行反轉錄。取總RNA 5ul，在20ul體系中以隨機六聚體為引物，應用AMV反轉錄酶合成第l鏈cDNA。反應完后，迅速冰上冷卻，室溫高速離心5 min，-20℃保存。PCR擴增反應：取5ml反轉錄產物為模板，依次加入下述組分：10×PCR反應緩沖液5ul，dNTP混合液(2.5mmol/L)4 ul，Taq DNA聚合酶ul，Cx37上、下游引物各0.5ul，β-actin上、下游引物各0.5ul，加無菌雙蒸水至50ul，在PCR合成儀中進行。實驗所用引物序列為：GJ蛋白Cx37：上游為5'-GACTGGGACTRACTGGAGAAG-3’。下游為5'-GCTACTGAGATCCTGGTCATC-3’。片段長度為413 bp；-actin：上游為5’-CATCAGTAGCTCGGAGTCCA-3’．下游為5’-ATAGTGTATGAGACTGTCAACA-3’，片段長度為308bp。熱啟動94℃ 2min．反應條件為94℃ 55s，58℃ 45s，72℃ 55s，共30個循環．最后一個循環在72℃延伸7min。擴增產物的電泳分析：lOulPCR反應液在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳分離，紫外透射分析儀觀察后照相。凝膠圖象分析系統對PCR的產物進行半定量分析，以Cx37mRNA擴增帶的光密度與β-actin擴增帶的光密度的比值代表細胞中mRNA的表達水平。

2 結果

2.1 HBO對大鼠CIR損傷后不同時間腦組織中EB含量的影響 模型組干預4h、12h、24h、48h及72h腦組織EB的含量與同時間點假手術組比較明顯增加(P<0.01),并以CIR損傷后4h滲出最多。模型+HBO組于CIR后4h 、12h、24h、48h及72h腦組織 EB的含量明顯低于同時間點模型組(P<0.01)。HBO組各時間點腦組織EB的含量與同一時間點假手術組比較差異無統計學意義。見表1。

2.2 Western Blot結果 模型組CIR損傷后4h、12h、24h、48h、72h腦組織Cx37蛋白的表達與0h相比明顯增加(P<0.01), CIR損傷后24h Cx37蛋白表達水平最高。見圖1，表2。

2.3 RT-PCR結果 所有樣品的A260/A280值均在1.8～2.0,表明總RNA純度較高，沒有蛋白質的殘余，質量可靠。總RNA變性瓊脂糖電泳結果顯示28S、18S、5S條帶均較為清楚，提示RNA提取較為完整、無降解。RT-PCR 結果顯示，模型組CIR損傷后4h、12h、24h、48h、72hCx37mRNA的表達較0h明顯增加(P<0.01),以CIR損傷后24h表達最明顯。見圖2，表3。

圖1 CIR損傷后不同時間模型組腦組織GJ蛋白Cx37與GAPDH灰度值的比較(%)

圖2 CIR損傷后不同時間點模型組腦組織GJ蛋白Cx37mRNA的表達(%)

2.4 HBO對CIR損傷后24h大鼠腦組織Cx37mRNA及蛋白表達的影響 RT-PCR和Western blot結果顯示，CIR損傷后24h模型組與假手術組相比腦組織Cx37mRNA及蛋白表達水平顯著增加(P<0.01)；模型+HBO組與CIR損傷后24h模型組相比Cx37mRNA及蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)；CIR損傷后24hHBO組與假手術組相比Cx37mRNA及蛋白表達差異無統計學意義。見圖3，表4。

表1 4組大鼠再灌注后各時間點腦組織中EB含量的比較

與同時間假手術組比較,aP<0.01;與同時間模型組比較,bP<0.01；與同時間HBO組比較,cP<0.01

表2 CIR損傷后不同時間點模型組腦組織GJ蛋白Cx37與GAPDH灰度值的比較

與0h比較，aP<0.01; 與4h、12h、48h及72h比較，bP<0.01

表3 模型組CIR損傷后不同時間點腦組織GJ蛋白Cx37mRNA表達的比較

與模型組CIR損傷后0h比較，aP<0.01;與模型組CIR損傷后4h、12h、48h及72h比較，bP<0.01

圖3 4組大鼠CIR損傷后24h腦組織GJ蛋白Cx37mRNA表達比較(%)

組別 nCX37蛋白CX37mRNA假手術組102.49±0.340.29±0.01模型組108.41±0.61a0.63±0.02a模型+HBO組104.36±0.21b0.43±0.02bHBO組102.48±0.320.28±0.01

與假手術組比較，aP<0.01;與模型組比較，bP<0.05

3 討論

腦缺血再灌注損傷是一個復雜的級聯反應,包括自由基損傷、鈣超載、炎癥反應等,最終導致神經細胞凋亡與壞死,引起腦功能障礙[7-9]。近年來研究表明，BBB完整性的破壞是缺血再灌注損傷造成重大危害的重要一環[10]。BBB是指腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿與腦脊液之間的屏障。BBB的完整性在維持中樞神經系統內環境的穩定中具有重要作用[11]。本實驗通過觀察腦組織中EB的含量來評價BBB的通透性。實驗觀察到CIR損傷后4h、12h、24h、48h、72h腦組織EB的含量與CIR損傷后0h相比明顯增加，以CIR損傷后4h腦組織EB的滲出量最多，說明此時BBB受損最嚴重。

Cx37基因位于人類染色體1p35.1,全長2727bp，由2個外顯子與1個內含子構成，編碼具有333個氨基酸的Cx37蛋白，起間隙連接作用，即6個Cx37在細胞膜上形成一個半通道，與相鄰細胞膜上的另一個半通道對接、裝配形成一個完整的通道，通過該通道完成鄰近間的同步應答[12-13]。Cx37 作為機體一類重要的GJ蛋白，可通過介導平滑肌細胞與內皮細胞間的信號轉導通路來調控血管內皮細胞的生長、增殖、衰老以及損傷后的再生等過程[14]；近年來，有研究表明Cx37在動脈粥樣硬化的發生和發展中起著重要的作用[15]。還有研究顯示，機械損傷可引起大鼠血管內皮細胞上Cx37表達下調，血管緊張素受體阻斷劑可以逆轉這種改變[16]。黃芬等[17]研究表明，自發性高血壓大鼠腦底動脈Cx37表達的變化與高血壓性腦血管疾病的發生密切相關。Cx37是腦組織中GJ通道的主要組成蛋白，其表達增加可加速細胞間信號傳導，促使GJ通道開放，是大量有害物質進入細胞，從而加速神經細胞損傷[18]。研究結果顯示, CIR損傷后CIR后腦組織GJ蛋白Cx37mRNA及蛋白的表達顯著增加，以再灌注24h表達最高，同時伴有BBB通透性的增加，此結果提示GJ蛋白Cx37在CIR損傷后導致初期BBB通透性增加的過程中發揮重要的作用。其作用機理可能是一方面增強表達的Cx37mRNA及蛋白可使腦血管內皮細胞發生離子點位的改變，誘導腦血管組織結構的損傷，導致BBB的通透性增加。 另一方面腦血管內皮細胞GJ蛋白Cx37mRNA及蛋白在CIR損傷后形成的半通道被激活開放，影響血管內皮細胞、平滑肌細胞及基質等相互間進行正常的化學和電信號交換，近一步加重BBB的損傷，造成BBB通透性進一步增加。

HBO因其能提高血氧分壓，增加血氧含量及毛細血管血氧血氧彌散距離，改善局部組織的缺氧狀態；促進抑制機體的氧化應激反應；能夠抑制局部缺氧缺血性炎癥損傷，被廣泛應用于臨床上腦血管疾病的治療[19]。前期的研究表明高壓氧在CIR損傷中通過增加GJ蛋白的表達具有降低BBB通透性的作用[20]。本研究在前期研究的基礎上進一步探討HBO在CIR損傷中降低BBB通透性的作用機理。本實驗通過觀察高壓氧對CIR損傷后24h腦組織GJ蛋白Cx37mRNA、蛋白的表達及BBB通透性作用的結果表明，CIR損傷后24h HBO能顯著降低腦組織GJ蛋白Cx37mRNA及蛋白的表達，從而降低BBB的通透性，這可能是HBO降低CIR損傷后BBB通透性的機制之一。

綜上所述，HBO能有效降低CIR后BBB的通透性，其作用可能與下調腦組織Cx37mRNA及蛋白表達，從而增加GJ蛋白表達密切相關，此研究為臨床上應用HBO治療腦血管疾病提供了實驗依據。