長鏈非編碼RNA HOTAIR在乳腺癌患者中表達(dá)及其臨床意義

高洪亮 邢福成

(天津市北辰醫(yī)院外科，天津 300400)

同源異型框基因翻譯基因間RNA(HOTAIR)，是目前研究較為透徹的長鏈非編碼RNA，其在人類多種實(shí)體腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)并可能與患者的預(yù)后和腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為密切相關(guān)〔1,2〕。長鏈非編碼RNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長度在200～100 000 nt之間的RNA分子，該RNA雖然不編碼蛋白質(zhì)，但其通過自身復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和龐大的種類發(fā)揮著包括表觀遺傳學(xué)調(diào)控在內(nèi)的多種生物學(xué)調(diào)控功能〔3〕。HOTAIR是新近發(fā)現(xiàn)的具有較多生物學(xué)功能的長鏈非編碼RNA，其參與了多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程。HOTAIR可在分子層面對(duì)乳腺癌細(xì)胞組蛋白進(jìn)行修飾，從而影響其侵襲轉(zhuǎn)移〔4,5〕。但HOTAIR表達(dá)水平與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)分析HOTAIR在多個(gè)數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)及高低表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系；采用q-PCR法檢測乳腺癌患者癌組織中HOTAIR表達(dá)情況及其與患者預(yù)后的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1數(shù)據(jù)庫選擇及分析 選取Oncomine(https://www.oncomine.org/)、Kaplan-Meier plotter(www.kmplot.com)和TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相關(guān)分析。在Oncomine數(shù)據(jù)入選限定條件為：乳腺癌；對(duì)比乳腺癌組織和正常乳腺組織中HOTAIR的差異表達(dá)情況；mRNA為表達(dá)水平；差異表達(dá)級(jí)別(logFC)大于2倍。在Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)檢索乳腺癌數(shù)據(jù)集，計(jì)算無疾病進(jìn)展生存，對(duì)腫瘤病理類型、臨床分期、分級(jí)等不作限制。TCGA數(shù)據(jù)庫選擇腺癌，且具有生存分析數(shù)據(jù)。

1.2組織標(biāo)本 選擇天津市北辰醫(yī)院2015年1月至2018年12月收治并經(jīng)手術(shù)治療的乳腺癌患者72例，均為女性，平均年齡(56.8±12.6)歲。患者術(shù)前均未接受過放化療等新輔助治療。手術(shù)標(biāo)本切除后，立即放入事先準(zhǔn)備好的液氮罐中冷凍，再將組織置于-80℃冰箱保存，用于后期提取總mRNA。根據(jù)乳腺癌患者HOTAIR在腫瘤組織中表達(dá)水平的中位數(shù)，分為高表達(dá)組與低表達(dá)組。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR 采用Trizol試劑對(duì)乳腺癌組織、癌旁組織進(jìn)行裂解，經(jīng)氯仿混合震蕩離心，再經(jīng)異丙醇沉淀，提取總RNA。應(yīng)用Takara公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用Toyobo公司的SYBR GREEN MASTER MIX，在ABI 7500 96孔實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，定量檢測HOTAIR的表達(dá)情況。

1.4統(tǒng)計(jì)分析 采用Stata10.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、生存分析繪制生存曲線并進(jìn)行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1HOTAIR在乳腺癌中的表達(dá) Oncomine數(shù)據(jù)庫分析顯示，HOTAIR在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常乳腺組織(P<0.05)，見圖1。

A：HOTAIR在多種腫瘤中的表達(dá)情況；B:HOTAIR在2個(gè)芯片數(shù)據(jù)集中的表達(dá)；C:乳腺癌組織與正常乳腺組織中HOTAIR差異表達(dá)的柱狀圖圖1 Oncomine數(shù)據(jù)庫分析HOTAIR在乳腺癌中的表達(dá)情況

2.2HOTAIR表達(dá)與患者預(yù)后 Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，高低表達(dá)組239153_at (HR=1.29,95%CI:0.94～1.76,P>0.05)和1557051_s_at(HR=0.92,95%CI:0.67～1.29,P>0.05)總生存期(OS)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但數(shù)據(jù)集進(jìn)行分析239153_at呈現(xiàn)出高表達(dá)患者生存期較短的趨勢(shì)，見圖2。

2.3TCGA數(shù)據(jù)分析HOTAIR HOTAIR在乳腺癌中拷貝數(shù)異常率為0.1%， 見圖3。而HOTAIR表達(dá)水平在各種突變情況下差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

圖2 HOTAIR高低表達(dá)患者OS生存曲線

圖3 TCGA數(shù)據(jù)庫中HOTARI表達(dá)

圖4 HOTAIR在2個(gè)數(shù)據(jù)集中的相對(duì)表達(dá)水平

2.4q-PCR驗(yàn)證 癌組織中HOTAIR相對(duì)表達(dá)量(8.36±3.78)顯著高于癌旁組織(5.26±3.33，P<0.05)。高表達(dá)組生存期顯著低于低表達(dá)組(HR=1.45,9%CI:1.08～2.32,P<0.05)。

3 討 論

全球每年新發(fā)乳腺癌病例130 萬，死亡40 萬，乳腺癌已成為繼肺癌之后發(fā)病率及死亡率最高的實(shí)體腫瘤〔6〕。近年來隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)行為的研究不斷深入，越來越多的研究已從分子水平上證實(shí)乳腺癌是一種具有一定遺傳背景的疾病，患者基因水平上的改變?cè)谌橄侔┌l(fā)生及轉(zhuǎn)移過程中起重要作用，早期乳腺癌可接受手術(shù)治療，預(yù)后較好5 年生存率可達(dá)90%以上，但已發(fā)生轉(zhuǎn)移的乳腺癌預(yù)后較差〔7,8〕。因此，探尋乳腺癌發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移的機(jī)制、早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌轉(zhuǎn)移高危人群或高危相關(guān)因素，并加以預(yù)防和治療是提高乳腺癌預(yù)后的重要途徑之一〔9～11〕。

HOTAIR作為長鏈非編碼RNA的重要成員之一，與乳腺腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。HOTAIR是HOXC基因簇的一條反義鏈，作為組蛋白修飾復(fù)合物的腳手架，其5′端結(jié)構(gòu)域與PRC2復(fù)合體結(jié)合，3′端結(jié)構(gòu)域與LSD1/CoREST/ REST復(fù)合體結(jié)合〔12〕。而HOTAIR能同時(shí)結(jié)合這兩個(gè)復(fù)合體，并將其募集到特異性的基因組位點(diǎn)，從而使該染色體處于封閉狀態(tài)而使其基因沉默〔13,14〕。Gupia等〔13〕首先采用基因芯片技術(shù)對(duì)乳腺癌細(xì)胞及正常細(xì)胞進(jìn)行長鏈非編碼RNA表達(dá)譜的差異選擇，發(fā)現(xiàn)HOTAIR表達(dá)水平明顯高于正常乳腺細(xì)胞，進(jìn)一步采用分子克隆技術(shù)和microRNA干擾技術(shù)將帶有HOTAIR基因的表達(dá)載體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞(microRNA干擾其表達(dá))發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)HOTAIR基因的乳腺癌細(xì)胞其增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移能力明顯高于轉(zhuǎn)染前，microRNA干擾后乳腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯下降，在細(xì)胞學(xué)上證明HOTAIR與乳腺癌轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為有密切關(guān)系。本研究生物信息分析顯示HOTAIR高或低表達(dá)與患者的預(yù)后無關(guān)，但其中一個(gè)芯片數(shù)據(jù)集提示高表達(dá)患者已呈現(xiàn)總生存期較短的趨勢(shì)。進(jìn)一步采用組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果提示HOTAIR在乳腺癌中高表達(dá)，且與患者預(yù)后相關(guān)，可作為乳腺癌患者預(yù)后潛在的分子標(biāo)志物。