異甘草素通過降低ROS產生抑制順鉑誘導的NRK-52E細胞衰老

刁會 王麗 譚睿陟 李健春 樊均明，3

(西南醫科大學 1附屬醫院腎病內科，四川 瀘州 646000；2附屬中醫醫院中西醫結合研究中心；3成都醫學院)

隨著人口老齡化社會的到來，衰老和抗衰老研究已成為醫學界的一大熱點。目前衰老相關理論或學說包括氧化應激、遺傳基因、線粒體DNA損傷、自由基、自身免疫、神經內分泌、體細胞突變、中醫腎虛等學說。在中醫理論中，腎中精氣虧虛是衰老發生的根本機制之一,腎陰、腎陽的盛衰可直接、間接影響人的壽命和生命質量，故腎臟是衰老最重要的影響因素。順鉑(Cis)作為廣泛用于臨床治療腫瘤(肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等)的化療藥物〔1〕，其作用機制是與DNA結合，引起交叉聯結，破壞DNA的功能，從而影響細胞的有絲分裂，因此Cis的使用過程中不可避免的也會產生一些副作用，包括引起急性腎損傷等腎毒性不良反應〔2〕。而Cis所致的腎損傷，目前除了腎臟替代治療和水合療法有一定的療效外，尚缺乏更為有效的治療手段。Cis及其代謝產物可能會通過腎小管上皮細胞外的離子轉運通道被吸收〔3〕，毒物的重吸收使腎小管上皮細胞遭受到有害刺激，從而產生大量活性氧(ROS)，使機體氧化和抗氧化系統平衡被破壞，氧化應激形成，而氧化應激又是導致腎小管上皮細胞損傷乃至衰老的關鍵因素〔4〕。因此，加強對Cis誘導的腎臟細胞衰老和氧化應激對防治腎臟損傷具有重要臨床意義。 異甘草素(Iso)為甘草中的異黃酮類化合物，已有研究表明其具有較為廣泛的藥理活性〔5〕，本研究擬分析Iso對Cis及其代謝產物誘導大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E衰老的作用及其相關機制。

1 材料和方法

1.1材料 NRK-52E細胞購自ATCC;胎牛血清(FBS) 購自Gemini公司；Cis購自西南醫科大學附屬醫院腫瘤科；Iso購自普瑞法公司〔高效液相色譜法純度>95 %〕； CCK-8試劑盒購自Promega公司；4,6-二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染料購自Vector公司；二氯二氫熒光素-二乙酸酯 (DCFH-DA) ROS檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素標記的膜聯素Ⅴ/碘化丙啶 (AnnexinⅤ-FITC/PI) 細胞凋亡檢測試劑盒、細胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物科技公司；實時聚合酶鏈反應(PCR)試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司；白細胞介素(IL)-1、IL-6酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；過氧化氫(H2O2)購自西南醫科大學附屬醫院藥房。

1.2NRK-52E細胞培養和實驗分組 NRK-52E細胞用含10%FBS的DMEM高糖培養基培養于37℃、5%CO2環境，細胞匯合度達到90%～95%并處于對數生長期時,采用0.25%胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化傳代備用。根據CCK-8法檢測細胞活性結果,將細胞分為NC組，4 μmol/L Cis組，5、10、15 μmol/L Iso組，Cis+H2O2組，Cis+10 μmol/L Iso+0.02% H2O2組。

1.3CCK-8法檢測NRK-52E細胞活性 NRK-52E細胞以5×104個/孔接種于96孔板,每組設5個復孔。培養24 h后,分別予以0、2、4、8、16 μmol/L Cis和0、5、10、15、20、25 μmol/L Iso刺激細胞48 h及0.000%、0.002%、0.005%、0.010%、0.020%、0.050%、0.100%、0.200%、0.500% H2O2刺激細胞30 min；吸出培養基,加入含100 ml/L CCK-8培養基,每孔100 μl,繼續培養3 h。在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔吸光度 (A450) 值,根據結果計算Iso安全劑量范圍、Cis有效毒性劑量范圍及H2O2毒性劑量范圍。

1.4衰老相關β半乳糖苷酶染色 在6孔板中,每孔接種5×104個細胞。培養24 h細胞貼壁后,給予處理,分為NC組，Cis組、5、10、15 μmol/L Iso處理細胞1 h后換液,再予以Cis聯合Iso刺激細胞為Cis+Iso 5 μmol/L組、Cis+Iso 10 μmol/L組、Cis+Iso 15 μmol/L組。48 h后棄去培養基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次,加入1 ml β半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸除細胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 ml染色工作液(按說明書配制)。37℃孵育過夜(不能在CO2培養箱中進行)，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發。去除染色工作液，加入2 ml PBS，普通光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5即時聚合酶鏈鎖反應檢測衰老相關分泌表型 引物由上海生物工程有限公司合成，GAPDH上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;轉化生長因子(TGF)-β1上游引物:5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′,下游引物：5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′；IL-1β上游引物:5′-TTCAAATCTCACAGCAGCAT-3′，下游引物:5′-AGGTCGTCATCATCCCAC-3′；IL-6上游引物:5′-AAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCT-3′，下游引物：5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3′ ；腫瘤壞死因子(TNF)-α上游引物:5′-GGAAAGCATGATCCGAGAT-3′,下游引物:5′-GTAGACAGAAGAGCGTGGTG-3′。5×104個細胞接種于6孔板中。處理方法及培養時間同上。48 h后棄去培養基，PBS清洗一次，按照總 RNA試劑盒說明書提取細胞RNA，逆轉錄為cDNA，并按照試劑盒說明書進行實時PCR，反應條件:95℃ 2 min，40 個循環；95℃ 15 s；60℃ 1 min。以GAPDH內參進行校正后，比較循環閾值(CT) 的方法對靶基因IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達水進行相對定量分析。

1.6ELISA檢測衰老相關分泌表型 6孔板每孔接種5×104個NRK-52E細胞，處理方法及培養時間同上。48 h后,收集各組細胞培養上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測IL-1β、IL-6，最后在酶聯免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度 (A450)值。

1.7AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色結合流式細胞術檢測NRK-52E細胞凋亡 6孔板每孔接種5×104個NRK-52E細胞,處理方法及培養時間同上。分別收集每孔細胞培養液,加入(不含EDTA)的胰蛋白酶消化細胞,用相應的培養液終止消化；收集細胞懸液離心,棄上清；PBS重懸細胞,再次離心,用結合緩沖液重懸細胞，并取100 μl細胞懸液，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC混勻后于室溫避光封閉5 min,后加入10 μl PI,并加40 μl PBS調整每管細胞體積為500 μl,立刻進行流式細胞術檢測。

1.8DCFH-DA染色法結合流式細胞術測定細胞內ROS水平 接種6孔板,每孔接種5×104個NRK-52E細胞，處理方法及培養時間同上。用無血清培養液稀釋DCFH-DA (1∶8 000),棄孔內培養基,PBS清洗1次；每孔加入約1 ml已稀釋的DCFH-DA,轉移至培養箱內培養30 min；PBS洗滌細胞2次后,胰蛋白酶消化收集細胞。500 μl無血清培養液重懸細胞，過濾去除細胞團,流式細胞術采集數據。

1.9統計學分析 采用SPSS21.0、Graphpad Prism 7.0統計學軟件進行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。

2 結 果

2.1Cis誘導法建立NRK-52E細胞衰老模型 Cis能顯著升高TGF-β1、TNF-α表達；不同濃度Cis造模，可引起腎小管上皮細胞產生衰老現象，以8 μmol/L以上Cis濃度可引起細胞形態的明顯變化；綜合以上結果，選擇4 μmol/L Cis為最佳有效實驗濃度。見圖1，表1。

2.2Iso對Cis誘導NRK-5E細胞衰老的影響 CCK8法結果顯示低于15 μmol/L的Iso無明顯影響,15 μmol/L及以上濃度對細胞活性有顯著抑制作用(P<0.01)，其中NC組細胞活性為0.64±0.02，5 μmol/L Iso組為0.65±0.03，10 μmol/L Iso組為0.66±0.02，15 μmol/L Iso組為0.66±0.01，20 μmol/L Iso組為0.59±0.02，25 μmol/L Iso組為0.52±0.02。光學顯微鏡顯示，與NC組比較，4 μmol/L Cis組細胞內有大量的細胞被染為深藍色，部分細胞胞體萎縮或變大、漂浮；與4 μmol/L Cis組比較，Iso各劑量組細胞內被半乳糖苷酶染成藍色的細胞數量明顯減少，以10 μmol/L Iso尤為顯著。見圖2。

圖1 不同Cis濃度處理下衰老相關β-半乳糖苷酶酶染色(×100)

表1 各組TGF-β1、TNF-α比較

與NC組比較：1)P<0.05

2.3Iso對Cis誘導NRK-52E細胞衰老相關分泌表型的影響 實時PCR結果顯示，與NC組相比，Cis組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達明顯升高(P<0.05)；Iso各劑量組與Cis組相比均顯著降低(P<0.05)。ELISA結果顯示，與NC組相比，Cis組IL-1β、IL-6表達顯著升高(P<0.05)；Iso各劑量組與Cis組相比，IL-1β、IL-6表達顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖2 衰老相關β半乳糖苷酶染色檢測各組細胞衰老情況(×100)

組別TGF-β mRNATNF-α mRNAIL-6 mRNAIL-1β mRNAIL-6IL-1βNC組0.004 000±0.002 4000.000 310±0.000 0400.000 013±0.000 0020.003 230±0.000 3302.550 0±0.420 325.600±3.050Cis組0.010 600±0.002 5002)0.000 530±0.000 0302)0.000 099±0.000 0282)0.005 050±0.000 5202)6.475 0±0.411 32)59.000±6.1242)Cis+Iso 5 μmol/L組0.006 400±0.001 5001)0.000 420±0.000 0401)0.000 066±0.000 0041)0.004 230±0.000 3601)5.825 0±0.250 01)56.400±4.9301)Cis+Iso 10 μmol/L組0.005 200±0.000 8001)0.000 340±0.000 0401)0.000 060±0.000 0081)0.003 680±0.000 2801)4.750 0±0.208 21)47.200±3.1141)Cis+Iso 15 μmol/L組0.007 100±0.000 8001)0.000 410±0.000 0301)0.000 077±0.000 0111)0.004 150±0.000 2901)4.625 0±0.340 31)50.200±3.9621)F/P值6.216/0.00923.63/0.00014.74/0.00013.94/0.00078.78/0.00045.23/0.000

與Cis組比較：1)P<0.05;與NC組比較：2)P<0.05

2.4Iso有效抑制Cis誘導的NRK-52E凋亡 流式細胞術檢測Cis誘導后腎小管上皮細胞48 h后的凋亡情況，與NC組(12%)相比，Cis組凋亡(61%)明顯增多(P<0.01)；與Cis組相比，Cis+Iso 5 μmol/L、Cis+Iso 10 μmol/L、Cis+Iso 15 μmol/L組細胞凋亡(25%、23%、33%)明顯減少(P<0.01)。見圖3。

2.5Iso抑制Cis誘導的細胞內ROS水平升高 CCK-8法結果顯示0.02%濃度以上的 H2O2處理NRK-52E細胞30 min后對細胞活性有明顯抑制作用；流式檢測ROS水平的結果顯示，與NC組相比,Cis組產生ROS的細胞數明顯增加(P<0.01)；與Cis組相比,Cis+Iso 10 μmol/L組ROS水平顯著降低；加入H2O2后的各組均較未加入前明顯增加(P<0.01)；但Cis+H2O2+Iso 10 μmol/L組ROS表達水平顯著低于Cis+H2O2組(P<0.01)。見圖4，圖5。

圖3 流式細胞術檢測各組細胞凋亡

黑色箭頭指示藍色深染衰老細胞圖4 衰老相關β-半乳糖苷酶染色檢測各組細胞衰老情況(×100)

圖5 流式細胞術檢測各組ROS變化

3 討 論

Cis是一種治療惡性腫瘤的重要抗癌藥物，但具有毒性副作用，如耳毒性、腎毒性和神經毒性。盡管進行預防性水合療法，但仍有約30%的CP患者會出現腎毒性〔6〕。既往研究表明〔7〕，ROS的產生參與了Cis誘導的腎毒性發展。ROS可誘導炎性細胞因子如TNF-α及其他氧化介質的產生。這些炎癥和氧化介質導致腎小管細胞和腎組織損傷。研究發現〔8〕，腎小球、腎小管，特別是近曲小管和集合管是Cis腎損傷的主要靶位，而其發病機制與氧化應激有密切關系。Cis通過腎小管上皮細胞的重吸收進入細胞后可破壞線粒體結構，使ROS產生增加。而大量的ROS可誘導內質網腔內鈣離子向胞質釋放，引發內質網應激。由此可見，氧化應激在Cis誘導的細胞衰老中起重要作用，與其他途徑互為因果關系，共同加速細胞衰老甚至凋亡。本研究發現Cis對NRK-52E細胞刺激48 h 后，細胞內ROS水平明顯增加，并用衰老相關β-半乳糖苷酶染色等一系列實驗驗證細胞衰老現象的出現，證明建模成功。

Iso為甘草中的異黃酮類化合物，已有研究表明Iso具有較為廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎及對心臟和腦的保護等作用〔9〕。Zhao等〔10〕研究發現Iso可通過抑制M2巨噬細胞極化而有效防治大腸桿菌相關腫瘤的發生。Denzer等〔11〕證明在氧化和亞硝化應激細胞模型中，Iso能改善線粒體功能。任歡歡等〔12〕通過Iso預處理可以逆轉I/R誘導的損傷效應，減輕I/R心肌損傷，作用機制可能與其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用相關。而Cis誘導的腎小管上皮衰老細胞通過自分泌和旁分泌途徑分泌大量促炎因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶等，影響臨近細胞和組織的微環境，加速衰老，衰老細胞的這一特征被定義為衰老相關分泌表型(SASP)，常見的SASP有：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β等。Zhang等〔13〕研究證明Iso能抑制IL-1β誘導的關節軟骨細胞基質金屬蛋白酶的產生，Chen等〔14〕研究表明Iso通過阻斷IL-6信號傳導抑制多發性骨髓瘤的生長，本實驗證實Iso能降低細胞衰老相關表型，減緩細胞衰老，與既往不同疾病中的研究結果相似，但關于Iso對Cis誘導腎小管上皮細胞凋亡前衰老過程的影響研究甚少。Patricia Moreno-Londoo等〔15〕研究表明Iso預處理可減輕Cis誘導的近端小管細胞的死亡，增強Cis膀胱癌T24細胞株的毒性。本研究結果顯示，Iso能有效抑制Cis誘導的 NRK-52E 細胞衰老，提高細胞存活率，其機制可能與抑制ROS產生有關。在細胞氧化應激研究中，Wang等〔16〕發現通過增加H2O2，可刺激ROS的表達，而Vashistha等〔17〕證實在HG培養基中ROS代謝顯著增加，與通過細胞凋亡和獲得衰老表型的細胞死亡增加有關。本研究結果提示Iso可通過降低ROS的產生抑制Cis誘導的大鼠NRK-52E細胞衰老。

綜上，Iso可能通過降低 NRK-52E 細胞內ROS 水平，減少衰老相關表型的表達，從而抑制細胞衰老。由此推測，在臨床上，對于Cis化療的腫瘤患者，適當加用Iso治療，不僅增強Cis抗腫瘤作用，還能緩解Cis引起的腎臟衰老。