響應面法優化外源因子對酵母菌的油脂代謝研究

陳韻，陸麗珠，張瑾，梁舒妍，江志彬，王漫君，鐘先鋒

（佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東佛山528225）

當今社會的快速發展，使得人類所面臨的能源和環境壓力日益增大，為解決這個問題，各國均在努力多渠道開發可再生生物質資源。生物柴油因其具有可再生、環境友好、與柴油成分相近等優點成為解決此問題的熱點研究方向[1]。目前用于生物柴油生產的原料主要是動植物油脂、餐飲地溝油等[2-3]。但動植物油脂成本較高，且供給有限，限制了生物柴油規模化生產[4-7]。產油微生物中酵母菌油脂脂肪酸組成與植物油相似，且含量高，是代替動植物油脂成為制備生物柴油的重要原料[6，8-9]。與植物油和動物油生產相比，微生物細胞生長十分迅速、生長周期較短，同時微生物生長所需原料來源比較廣泛，具有利用一些農業廢棄物的水解物作為生長所需營養物質的能力，能夠解決能源短缺問題的同時還有利于環境保護[10-12]。

微生物油脂的合成都是從乙酰輔酶A的合成開始，再經過多次碳鏈延長后，在去飽和酶的去飽和作用下，最終生成油脂[13]。在油脂合成的過程中，添加脂肪酸合成過程中所產生的中間產物，或能影響脂肪酶活性的物質，如乙酸鹽、甘油等，以及某些維生素B類物質，可提高油脂的含量[13]。本研究以充分利用木質纖維且進一步生產微生物油脂為目的，采用響應面優化法研究添加外源因子對酵母菌產油脂代謝的影響，通過因素交互作用分析，建立響應面回歸模型，對各因素進行優化，以確定各外源因子的最佳添加配方，以期加快利用木質纖維素水解液生產微生物油脂的工業進程。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

圓紅冬孢酵母（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

玉米秸稈：佛山科學技術學院食品科學與工程學院。

1.1.2 培養基

固體培養基：5°Bé麥芽汁 1.0 L，瓊脂 15.0 g，自然pH值。

種子培養基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉2 g/L，葡萄糖4 g/L，自然pH值。

玉米秸稈水解液的培養基：KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，酵母粉 2 g/L。

以上培養基均要在121℃，0.1MPa下滅菌20min。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種培養

斜面培養：將已活化的菌種接種到固體培養基中，在28℃，180 r/min的條件下培養2 d。

種子培養：將斜面培養基中菌種接種幾環到裝有100 mL液體培養基的錐形瓶中，在28℃，180 r/min條件下培養48 h后，得到種子液。

產脂發酵：將上述得到的種子液接種到玉米秸稈水解液培養基中，搖床培養1 d～12 d。

1.2.2 玉米秸稈粗水解液的制備

稱取80 g玉米秸稈粉末，置于1 000 mL三角瓶中，加入800 mL濃度0.5%的稀硫酸，振蕩搖勻，121℃預處理90 min，冷卻后調節pH值至5.5，再加入2.5%纖維素酶和木聚糖酶混合物（1∶1，質量比），50℃水解48 h后，離心取上清液，得玉米秸稈粗水解液。

1.2.3 玉米秸稈水解液脫毒處理

向粗水解液中加入Ca（OH）2粉末，調節pH值至10，靜置1.5 h，過濾，除去水解液中的沉淀。濾液用5 mol/L的H2SO4調節pH值到5.5，靜置1 h后過濾取上清液，然后沸水浴20 min，待其冷卻后過濾備用。

向經脫毒處理的玉米秸稈水解液中添加KH2PO41 g/L，MgSO41.5 g/L，（NH4）2SO40.5 g/L，CaCl20.5 g/L，酵母粉2 g/L，制備利于微生物發酵產油脂的玉米秸稈水解液培養基。

1.2.4 生物量的測定

發酵液在4 000 r/min離心10 min，收集菌體在105℃烘干至恒重。

1.2.5 油脂含量、油脂產量測定

將發酵液離心收集菌體，每克濕菌體加入10 mL濃度4 mol/L的鹽酸，振蕩搖勾，室溫（25℃）放置半小時后，沸水浴10 min，-20℃冷凍30 min。加入乙醚和石油醚的混合液20 mL（體積比為1∶1）振蕩搖勻，4 000 r/min離心10 min，萃取有機層。再加入乙醚和石油醚的混合液，重復上述步驟，合并有機層，混合后離心，揮發機層。于105℃，烘至恒重，冷卻后計算油脂含量和油脂產量。

1.2.6 總糖測定

試驗參考文獻[14]的方法，采用3，5-二硝基水楊酸法測定培養基中還原糖濃度。以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，擬合得到線性回歸方程y=0.486x+0.001 1，相關系數R2=0.999 5。

1.2.7 單因素試驗設計

分別添加不同濃度的甘油（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、乙酸鈉（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）、檸檬酸鈉（0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%）、維生素B6（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）至玉米秸稈水解液培養基中，考察了4種外源因子對酵母菌發酵培養基產油脂的影響。

1.2.8 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，以乙酸鈉（A）、維生素B6（B）、甘油（C）、檸檬酸鈉（D）為自變量，以生物量（Y1）、油脂含量（Y2）、油脂產量（Y3）為響應值，使用 Design-Expert 8.0.6軟件設計響應面試驗，因子編碼及水平見表1。

表1 響應面試驗設計因素和水平Table 1 Factor and levels in response surface analysis

1.3 數據分析

試驗數據用Office Excel 2010統計分析，Design-Expert 8.0.6軟件，Origin 9.0軟件等進行統計分析、作圖。單因素試驗中用單因素試驗統計進行方差分析處理，處理后采用Duncan新復極差法進行比較，并使用字母標記法進行標記。

2 結果與分析

2.1 酵母菌發酵玉米秸稈水解液培養基產油脂

采用酸水解結合酶解的方法制備玉米秸稈水解液培養基，3，5-二硝基水楊酸法測到培養基的總糖為24.332 g/L。將種子液接種到玉米秸稈水解液培養基中，28℃，180 r/min條件下搖床培養7 d，測到生物量為18.79 g/L、油脂含量30.31%、油脂產量5.70 g/L。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 甘油對酵母產油脂的影響

甘油在磷酸化作用下轉變為油脂合成所需要的3-磷酸甘油，從而為油脂提供合成的前體[15]。甘油對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響見圖1。

圖1 甘油對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響Fig.1 Effects of glycerin on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由圖1可知，當添加0.1%～0.5%甘油時，生物量、油脂含量、油脂產量都呈現先增大后減小的變化趨勢，在甘油添加量為0.3%時有最大值，分別為生物量20.12 g/L、油脂含量30.68%、油脂產量6.17 g/L。隨著甘油濃度增大，以上指標均下降，原因可能是加入過量甘油后培養基在搖瓶培養的過程中容易起泡，泡沫過多會影響到培養基中氧氣的溶解度，最終會影響菌體油脂的積累[16]。綜合上述指標評價，選擇添加甘油0.20%～0.40%進行Box-Behnken響應面法優化試驗。

2.2.2 乙酸鈉對酵母產油脂的影響

乙酸鈉可促進無活性的單體聚合成有活性的全酶，從而加速脂肪酸的合成。乙酸鈉中含有的乙酰基能和輔酶A結合，轉化生成的乙酰輔酶A是脂肪酸合成和能量代謝的重要前體，因而可以為脂肪酸合成提供更多的底物供應[17-18]。乙酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響見圖2。

圖2 乙酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響Fig.2 Effects of sodium on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

由圖2可知，乙酸鈉添加量0.1%～0.3%，生物量、油脂含量、油脂產量均增加，在0.3%時有最大值，分別為17.28 g/L、30.26%、5.23 g/L。當添加量超過0.3%時，生物量、油脂含量、油脂產量都顯著減小。原因可能是乙酸鈉添加過量會改變培養基的pH值，從而影菌體的正常的生長[17]。綜合上述指標評價，選擇添加乙酸鈉0.20%～0.40%進行Box-Behnken響應面法優化試驗。

2.2.3 檸檬酸鈉對酵母產油脂的影響

乙酰輔酶A是微生物在體內積累油脂的必備因子，它主要存在于線粒體中，而脂肪酸的合成是在細胞質內，乙酰輔酶A以檸檬酸的形式通過三羧酸循環系統從線粒體運送到細胞質中，其中檸檬酸作為重要的中間產物，對油脂的合成起著重要的作用[19]。Brown等[20]研究表明檸檬酸是脂肪酸合成的主要前體物質，是油脂合成啟動的源頭。研究檸檬酸鈉添加量對酵母菌產油脂的影響結果見圖3。

圖3 檸檬酸鈉對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響Fig.3 Effects of sodium citrate on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

如圖3所示，加入一定量的檸檬酸鈉，菌體的生物量、油脂含量、油脂產量等升高，但加入過量時以上指標均下降，原因可能是檸檬酸鈉作為一種鹽類，加入過量時對菌體表面細胞膜產生負面影響，從而影響菌體對培養基中離子的吸收利用。綜合上述指標評價，選擇添加檸檬酸鈉0.40%～0.80%進行Box-Behnken響應面法優化試驗。

2.2.4 維生素B6對酵母產油脂的影響

丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase，Pyc）是胞質還原三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA循環）途徑中的關鍵酶，它通過CO2固定催化丙酮酸轉化為草酰乙酸，而如果體系中沒有足夠的草酰乙酸參與到檸檬酸的合成，檸檬酸的缺乏會成為油脂合成的限速步驟[21]。因此，Pyc在脂肪酸的生物合成中發揮重要作用，維生素B6提高Pyc的活性，減少丙酮酸的積累，最終促進油脂的合成[22-23]。同時，維生素B6是脫氫酶的輔酶，它能提高脫飽和酶的活性，促進脂肪酸脫氫生成雙鍵，最終能夠提高脂肪酸的不飽和度[24]。維生素B6對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響見圖4。

如圖4所示，當維生素B6添加量0.01%到0.05%，菌體生物量在14.96 g/L到16.16 g/L變化，在添加量為0.04%時有最大值16.16 g/L，變化幅度不大，說明添加維生素B6對圓紅冬孢酵母菌體的生長影響不明顯。在添加量為0.02%時，油脂含量、油脂產量最大，分別為31.26%、4.6 g/L，說明添加適量維生素B6是有助于菌體發酵產油脂。綜合上述指標評價，選擇添加維生素B60.01%～0.03%進行Box-Behnken響應面法優化試驗。

圖4 維生素B6對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響Fig.4 Effects of vtamin B6on biomass，lipid content and lipid yield of bacteria

2.3 響應面優化外源因子對微生物產油脂的影響

在單因素試驗結的基礎上，使用Design-Expert 8.0.6軟件建立數學模型，以生物量、油脂含量、油脂產量為響應值，共設計了29個處理組，試驗結果見表2。

表2 Box-Behnken設計方案及響應值Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

續表2 Box-Behnken設計方案及響應值Continue table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding experimental polysaccharide yields

2.3.1 響應面回歸模型的建立和分析

利用Design-Expert軟件對表2試驗數據進行多元回歸擬合和方差分析，得到各因子對響應值的二次多項回歸模型為：

回歸方程模型方差分析（生物量）見表3，回歸方程模型方差分析（油脂含量）見表4，回歸方程模型方差分析（油脂產量）見表5。

表3 回歸方程模型方差分析（生物量）Table 3 ANOVA for response surface quadratic model（biomass）

表4 回歸方程模型方差分析（油脂含量）Table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

續表4 回歸方程模型方差分析（油脂含量）Continue table 4 ANOVA for response surface quadratic model（lipid content）

表5 回歸方程模型方差分析（油脂產量）Table 5 ANOVA for response surface quadratic model（lipid yied）

方差分析結果顯示，模型的p值均＜0.01，差異極顯著，而失擬項p值分別為0.785 3、0.175 3、0.624 3（p＞0.05），差異不顯著，說明未知因素對試驗結果的干擾較小，該試驗模型充分擬合試驗數據，即可以利用此回歸模型反映各因素對菌體生物量、油脂含量、油脂產量的影響。

在表3回歸方程模型方差分析（生物量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2影響均為極顯著（p＜0.01），交互項AB 影響顯著（p＜0.05），CD 影響極顯著（p＜0.01）。根據F值對各因素的影響大小順序為：D＞C＞A＞B，說明檸檬酸鈉對圓紅冬孢酵母生物量大小影響最大。

在表4回歸方程模型方差分析（油脂含量）中，交互項 AB、AC、AD、BC、BD、CD 的交互作用對響應值沒有顯著影響，而一次項和二次項對圓紅冬孢酵母發酵玉米秸稈水解液培養基的油脂含量的影響均為極顯著（p＜0.01），根據F值大小，一次項對響應值影響大小順序為：D＞B＞A＞C。

在表5回歸方程模型方差分析（油脂產量）中，A、B、C、D、A2、B2、C2、D2對響應值影響均為極顯著 （p＜0.01），A、B、C、D 各因素對酵母菌油脂產量的顯著性大小依次為：D＞B＞C＞A。交互項AD、CD對響應值影響極顯著（p＜0.01），BD 影響顯著（p＜0.05）。

乙酸鈉、維生素B6、甘油、檸檬酸鈉對菌體發酵玉米秸稈水解液產油脂影響顯著。

2.3.2 響應面交互作用分析與優化

響應面坡度越陡峭，等高線越密集并形成橢圓，說明兩因素對響應值的交互作用越顯著，反之則越不顯著[25]。圖5為各因素對菌體生物量的響應面分析圖。

圖5 各因素對生物量的響應面立體分析圖Fig.5 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to biomass

由圖5可見，結合表3方差分析結果，檸檬酸鈉和甘油的交互作用極顯著（p＜0.01），控制檸檬酸鈉濃度不變，隨著甘油濃度增大，生物量呈先上升后下降的趨勢，檸檬酸鈉也是如此；維生素B6和乙酸鈉的交互作用顯著（p＜0.05），生物量隨著兩者增大，表現出先增大后減小的趨勢，與方差分析結果一致。圖6為各因素對菌體油脂含量的響應面分析圖。

圖6 各因素對油脂含量的響應面立體分析圖Fig.6 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid content

由圖6可見，6組響應面立體分析圖的坡度都較陡，說明乙酸鈉、維生素B6、檸檬酸鈉、甘油等濃度增大都會使酵母的油脂含量產生顯著性的先增大后減小的變化趨勢。結合表4的方差分析結果，各因素間的交互作用對菌體油脂含量影響均不顯著（p＞0.05），但各因素對酵母發酵玉米秸稈水解液培養基產油脂影響顯著。圖7為各因素對菌體油脂產量的響應面分析圖。

由圖7可見，響應面立體分析圖的坡度較陡，說明各因素對酵母發酵玉米秸稈水解液培養基產油脂影響顯著。各響應值隨著各因素在一定范圍內變化，均表現出是先增大再減少的變化趨勢，說明在研究的因素水平范圍內有最大值，結合表5回歸模型方差分析結果，檸檬酸鈉和乙酸鈉、甘油的交互作用影響極顯著（p＜0.01），維生素B6和檸檬酸鈉的交互作用影響顯著（p＜0.05）。

圖7 各因素對油脂產量的響應面立體分析圖Fig.7 Three-dimensional analysis map of the response surface of each factor to lipid yield

2.3.3 最佳添加量驗證試驗結果

通過Design-Expert8.0.6軟件分析得到各外源因子添加量的最佳配方為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸0.66%，在此條件下，模型預測的生物量為28.82 g/L、油脂含量為43.18%、油脂產量為11.55 g/L。為了方便實際試驗操作，將試驗條件調整為乙酸鈉0.35%、維生素B60.02%、甘油0.3%、檸檬酸0.65%，得到的生物量為（29.32±0.35）g/L、油脂含量為（43.75±0.26）%、油脂產量為（12.11±0.18）g/L，相比優化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%，試驗結果偏差較小，數據穩定，證明該模型合理可靠。

3 結論

為進一步提高圓紅冬孢酵母菌（Rhodosporidium toruloides）CICC 32489菌株的油脂產量，本課題研究了外源因子對菌體生物量和產油脂情況的影響，先通過單因素試驗，確定外源因子的最佳添加量，在此基礎上，通過Box-Behnken試驗設計對乙酸鈉、甘油、維生素B6、檸檬酸鈉等4個因子進行響應面優化，得到的工藝參數為乙酸鈉0.33%、維生素B60.02%、甘油0.27%、檸檬酸鈉0.66%，生物量、油脂含量、油脂產量等相比優化前分別提高了56.04%、41.95%、109.15%，說明4種外源因子對酵母菌發酵玉米秸稈水解液培養基產油脂影響顯著。