白酒發酵過程中常見酵母菌扣囊復膜酵母的研究進展*

王居偉，韓培杰，王雪薇，周 森，王 勇，蔚慧欣，梁振榮，白逢彥**

(1.中國科學院微生物研究所真菌學國家重點實驗室，北京 100101；2.中國科學院大學，北京 100049；3.北京順鑫農業股份有限公司牛欄山酒廠，北京 101301；4.山西汾酒集團股份有限公司，山西汾陽 032205；5.廣西天龍泉酒業有限公司，廣西河池 546400)

0 引言

扣囊復膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)，又稱擬內孢霉，是子囊菌門(Ascomycota)酵母亞門(Saccharomycotina)下酵母綱(Saccharomycetes)酵母目(Saccharomycetales)酵母科(Saccharomycetaceae)復膜酵母屬(Saccharomycopsis)的一個種[1-2]。自Wickerham等[3]首次報道利用S.fibuligera水解淀粉以來，已有大量關于該物種產酶等性狀的研究。扣囊復膜酵母作為優勢菌株廣泛存在于淀粉質含量高的酒曲(如韓國酒曲Nuruk[4]、泰國酒曲Loog-pang[5]、紅曲和藥曲[6]、我國清香型白酒酒曲[7-9]等)和發酵前期的酒醅中，且隨著發酵進行數量迅速減少[4,10]。扣囊復膜酵母還對白酒香型、風味形成具有貢獻價值。本文介紹了扣囊復膜酵母的基本特征、產酶特性及其對白酒風味物質的影響，為利用組合菌株生產酒精飲料或篩選優良菌株用于白酒純種發酵提供參考依據。

1 扣囊復膜酵母的基本特征

了解扣囊復膜酵母的基本特征是運用該菌種進行白酒純種發酵的基礎，也是改良白酒生產工藝條件的依據。對扣囊復膜酵母基因組信息的解讀，有助于研究其次級代謝產物及調控規律，從而提高對酒體、風味物質的可操控性和穩定性。

扣囊復膜酵母具有典型的二型性，既存在大量分支狀的有隔假菌絲，又產生酵母狀的芽殖細胞[11]。當轉錄調控因子、Mig1(Multicopy Inhibitor of GAL Gene Expression)失活[12]，在碳源限制條件下培養(培養基中葡萄糖≤0.1%)或在培養基中加入線粒體呼吸鏈抑制劑抗霉素A(Antimycin A)[11]時，菌株趨向于酵母態生長。該酵母有性繁殖產生球形或卵圓形的子囊，呈游離狀或附著于菌絲末端或者側面。每個子囊可以形成2-4個帽子狀的子囊孢子，并在成熟時釋放[2]。

目前已公布的基因組分析結果[11]如表1所示。雜合菌株KJJ81包含兩個亞基因組(A型和B型)。推測由一共同祖先分化為兩個譜系(A型和B型)，從A型譜系中分化出菌株KPH12和ATCC36309。菌株KPH12與B型譜系菌株雜交，得到菌株KJJ81的祖先，丟失部分序列后形成菌株KJJ81[11](圖1)。雖然在酒曲中檢測到了B型譜系的菌株，但目前尚未分離到該譜系的純菌株[13]。

表1Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株基因組信息比較

Table 1 Genomic information comparison of several strains ofSaccharomycopsisfibuligera

StrainGenome size (Mb)Proteincoding gene numberScaffold numberGenome sequence identity (%) withKJJ81 subgenome AKJJ81 subgenome BKPH12ATCC36309Mitochondrial genome size (bp)KJJ8138.612 1851467 516KJJ81 subgenome A19.7NA7100.089.099.197.9NAKJJ81 subgenome B18.8NA789.0100.088.690.0NAKPH1219.76 155799.188.6100.098.067 427ATCC3630919.6NA797.990.098.0100.0NA

Note：NA indicates data not available

部分只含有A型基因組的菌株和含有A、B型基因組的雜合菌株具有形態差異：前者的菌落呈白色或微紅色，可通過菌絲吻合(Anastomosis)產生大量包含4個子囊孢子的子囊，而雜合菌株只呈現白色，產生較少的子囊[13]。在高溫和硫限制條件下，雜合菌株表現出更強的適應性[11,13]。

2 扣囊復膜酵母的產酶特性

目前關于扣囊復膜酵母的研究多集中于它所分泌的胞外水解酶，包括β-葡糖苷酶、淀粉酶、蛋白酶等。這些酶絕大部分在葡萄糖或硫限制條件下可被誘導表達，且受Mig1負調控[11-12]。扣囊復膜酵母產生的水解酶可以分解大曲、酒醅中的大分子物質，為釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等其他參與釀酒的微生物提供營養。

2.1 β-葡糖苷酶

纖維素酶包括內切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)[14]。纖維素先經內/外切葡聚糖酶降解為纖維二糖和寡糖，再由β-葡糖苷酶降解為葡萄糖。β-葡糖苷酶為限速酶，可以解除纖維二糖對內/外切葡聚糖酶的抑制，從而決定纖維素的降解速度和程度[15-16]。

目前已從扣囊復膜酵母中分離得到兩種β-葡糖苷酶：BGL1和BGL2，其蛋白序列高度相似(83%)，在不同pH值、溫度及熱變性條件下具有相近的酶學特性，但BGL1可以更有效地降解纖維二糖[17]。BGL1可被Cr6+、Mn2+和Fe2+激活，其中Cr6+的激活效果最顯著[18]。此外，還在菌株KPH12、KJJ81和ATCC36309的基因組中發現與BGL1基因具有一定同源性(55%)的BGL3，以及編碼裂殖酵母β-葡糖苷酶的同系物基因BGL4，但其功能尚未得到驗證[11]。

將扣囊復膜酵母的β-葡糖苷酶基因導入釀酒酵母S.cerevisiae菌株中可用于生產生物乙醇，包括將其整合到基因組中(如27rDNA區域)[19]或通過外源載體表達該基因。在優化外源載體表達條件時，發現利用組成型啟動子(Actin Promoter)表達要優于誘導型啟動子(Galactose-Inducible Promoter)[20]。分泌到胞外的β-葡糖苷酶在水解速率和乙醇產量上均優于胞內β-葡糖苷酶[21]。此外，乙醇產量與轉化菌株的遺傳背景也有相關性[20]。

*在亞基因組B譜系中某些非必需基因的缺失可能發生在雜交事件之后

*Some non-essential genes in the subgenome B lineage could occur after a hybridization event

圖1 基于基因組序列分析推測的S.fibuligera雜合二倍體菌株KJJ81形成過程(仿自Choo等[11])

Fig.1 Hybrid formation ofS.fibuligeraKJJ81 based on genome sequence analysis speculation (modified from Choo et al.[11])

2.2 酸性蛋白酶

酸性蛋白酶，也稱為天冬氨酸蛋白酶(EC 3.4.23)，具有以天冬氨酸位點為催化中心的兩個活性區域，特征序列分別為N端的Asp32-Thr-Gly-Ser和C端的Asp215-Thr-Gly-Ser/Thr[22]。酸性蛋白酶在白酒發酵中的作用包括：(1)溶解顆粒狀原料并從顆粒上釋放被吸附的α淀粉酶[23-24]；(2)分解原料、死菌菌體蛋白生成的氨基酸,供釀酒酵母攝取利用，促進酵母菌生長繁殖[23-24]；(3)酵母中氨基酸合成的起始物多來自于糖代謝途徑中間產物，吸收利用外源氨基酸可減少自身氨基酸合成代謝，使底物用于酒精發酵，提高出酒率[24-26]；(4)氨基酸是白酒中高級醇的主要來源，而高級醇及其派生物是白酒中重要的呈香物質[24]。

扣囊復膜酵母中的酸性蛋白酶多為分泌型(Secreted Aspartyl Proteases，SAP)，在N端有作為分泌信號的疏水片段，在基因組中常含有多個拷貝[11,27]。扣囊復膜酵母中酸性蛋白酶的活性下降會增加海藻糖的積累量，提高淀粉酶的活性和穩定性[27]。

扣囊復膜酵母中酸性蛋白酶包括兩類，一類為天冬氨酸蛋白酶PEP1(Aspartic Protease PEP1)類同源物[28-29]，不含糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidylinositol，GPI)錨定基序(Anchor Motif)，這類酶在葡萄糖和硫限制條件下被誘導表達[11]；另一類為酵母天冬氨酸蛋白酶Yapsin (Yeast Aspartic Protease)類同源物，在C端具有GPI錨定基序，幫助其定位于細胞壁表面，這類酶為組成型表達[11,30]。

除了在白酒釀造過程中發揮作用，扣囊復膜酵母的酸性蛋白酶還可作為凝乳酶(Rennin)，在奶酪制作等方面具有巨大潛力。凝乳酶可特異性水解牛奶中κ-酪蛋白內的Phe105-Met106間肽鍵，破壞酪蛋白膠束，從而使牛奶絮凝。Yu等[31]在解脂耶羅維亞酵母(Yarrowialipolytica)菌株Po1h中克隆表達了S.fibuligera菌株A11的蛋白酶基因APG，篩選得到具有最大水解圈的轉化子71；從轉化子71培養基上清中純化得到重組酶，其分子量約為94.8 kDa，最適pH值為3.5，最適溫度為33℃；Zn2+可作為激活劑，而部分離子(Hg2+、Fe2+、Fe3+和Mg2+)、EDTA、EGTA、碘乙酸和胃蛋白酶抑制劑會抑制其酶活[31]。由于表面展示的酸性蛋白酶無需純化，可直接應用于凝乳過程，節省了成本。Yu等[30]將APG基因克隆至表面展示載體(Surface Display Vector)pINA1317-YlCWP110并在Po1h中表達，發現重組蛋白的His標簽會降低蛋白酶及凝乳酶活性。分離自海洋魚類腸道的Y.lipolytica菌株SWJ-1b具有用作單細胞蛋白的潛力，為提高其凝乳酶活性，Yu等[32]先將原有的蛋白酶基因AXP敲除，以防止其降解外源蛋白，隨后克隆表達了A11的酸性蛋白酶基因AP1，所得轉化子43酶活力(46.7 U/mg)高于此前得到的菌株Po1h轉化子71的酶活力(26.3 U/mg)；轉化子43中粗蛋白含量為43.53% (W∶W) ，略低于原始菌株SWJ-1b(45.63%)，但其凝乳酶活性優于原始菌株SWJ-1b，因此可用于生產凝乳酶，或作為食品工業中相應蛋白質的來源。

2.3 淀粉酶

淀粉是由直鏈淀粉(由α-1,4糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)和支鏈淀粉(分別由α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接D-葡萄糖殘基而成)組成，可被淀粉酶降解為葡萄糖、寡糖和糊精[33]。目前對扣囊復膜酵母中淀粉酶的研究多集中于α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)、葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)和生淀粉糖化酶。

2.3.1 α-淀粉酶

α-淀粉酶可催化水解淀粉中的α-1,4糖苷鍵，與其他淀粉酶協同作用，可將淀粉分解為α-極限糊精、寡糖、麥芽糖和葡萄糖[34]。

目前已報道的扣囊復膜酵母α-淀粉酶包括ALP1[35-36]、Sfamy KZ[37]、Sfamy R64[38]和SFA1[39]，其蛋白序列長度約為494個氨基酸，最適pH值為5.0-6.0，最適溫度為40-50℃;其蛋白N端與催化活性有關，C端與熱穩定性及結合淀粉的能力有關[38]。扣囊復膜酵母α-淀粉酶可少量降解生淀粉并具有底物濃度依賴性，但不能結合在淀粉顆粒上[37-38]。

扣囊復膜酵母α-淀粉酶的C端缺少由芳香族氨基酸組成的表面結合位點[40]，對其進行模擬改造(多個位點突變：S383Y/S386W/N421G/S278N/A281K/Q384K/K398R和引入環G400-S401)可提高其吸附淀粉的能力[40-41]。此外，利用化學修飾和點突變(S336C/S437C)也可提高α-淀粉酶的穩定性，保護輔助因子Ca2+，提高對胰蛋白酶的抗性[42-43]。在工業應用中，將扣囊復膜酵母α-淀粉酶基因與其他基因(S.cerevisiae谷氨酰半胱氨酸合成酶基因GSH1[44]，疏綿狀嗜熱絲孢菌(Thermomyceslanuginosus)葡糖淀粉酶基因TLG1[45])組合導入釀酒酵母中，可用以生產啤酒或生物乙醇發酵。

2.3.2 葡糖淀粉酶

葡糖淀粉酶可以從淀粉分子和α-1,4糖苷鍵連接的麥芽寡糖非還原末端逐步水解釋放β-葡萄糖[46]，也可以低效水解α-1,6糖苷鍵[47]。

目前已報道的扣囊復膜酵母葡糖淀粉酶包括GLU、GLA、GLL、GLM(表2)，此外也在部分菌株基因組中發現與白色念珠菌葡糖淀粉酶基因GAM1同源的開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)[11]。

表2Saccharomycopsisfibuligera幾個菌株的葡糖淀粉酶特性

Table 2 Enzymatic properties of glucoamylase from severalSaccharomycopsisfibuligerastrains

EnzymeStrainsOptimal pHOptimal temperature (℃)Km (mmol/L) maltooligosacharideMaltoseMaltotrioseMaltotetraoseMaltoheptaoseRaw starch digestionAmino acids of mature proteinAmino acids of signal peptideVariant sites in the protein moleculeReferencesGLU HUT72125.8501.970.40.0870.053No49227E27,N46,E166,A377,A410,Y461,G467[4853]GLA KZ5.0-6.240-501.820.330.0810.05No49227D27,D46,K166,V377,G410,N461,S467[46,4951,5354]GLL R645.6-6.450NANANANANo492NAD27,D46,E166,V377,A410,Y461,G467[4950]GLMIFO 0111 4.8-5.040NANANANAYes48926NA[49,5558]

Note：NA,data not available;Different colors indicate that variant sites in GLL are the combination of some variant sites in GLU and GLA

將GLU和GLA基因導入釀酒酵母表達， GLU酶活力高于GLA酶活力[46,59]。兩者信號肽及N端的變異對酶的表達水平沒有影響，而C端的變異會同時影響酶活力、底物特異性、最適溫度和最適pH值。糖基化程度不同會導致表達產物不均一，影響熱穩定性以及熱變性后的復性能力，但不影響酶活力[50,59]。將GLU中C端保守活性區域S5中的Gly467替換為GLA中的Ser，會使其與底物的親和性接近于GLA，酶的穩定性降低，但與底物類似物阿卡波糖的結合能力提高[50]。

菌株IFO 0111產生的單一淀粉酶GLM是目前唯一報道的，可以降解生淀粉的扣囊復膜酵母葡糖淀粉酶[56-57]，而GLU、GLA和GLL只能較弱地吸附但不能降解生淀粉[51]。這是由于GLM中含有更多的色氨酸和組氨酸，其中的芳香族氨基酸(如色氨酸)可以通過疏水堆積作用與底物的糖環結合[51]。GLM可水解淀粉、糖原和極限糊精等多種多糖產生葡萄糖。GLM具有很高的脫支活性(Debranching Activity)，對含支鏈底物(如支鏈淀粉、糖原和極限糊精)的降解程度很高，但不能徹底降解直鏈淀粉[60]，其降解生淀粉的最適pH值為4.5，而降解可溶性淀粉的最適pH值為5.5。當pH值為2.0-7.6時，GLM可以完全吸附在生淀粉上；該酶催化生淀粉的活性會被淀粉酶抑制劑阻遏，但其對淀粉的吸附性不受影響[57]。

大部分葡糖淀粉酶是由淀粉催化區域和結合區域通過O-糖基化區域連接而成[61]，但GLU和GLM都缺少獨立的淀粉結合區域，它們在酶的活性位點附近有一些與生淀粉結合相關的氨基酸殘基(GLM/GLU：D122/K121、H201/Y200、T204/S203、S205/T204、Q276/D277、S278/N282、S139/A138、E60/N60、V351/D354、T353/S356)[51]。在GLU表面距催化位點25 ?處有另一個淀粉結合位點，該位點處的Arg15、His447、Asp450、Thr462、Tyr464和Ser465具有重要作用。將其中部分氨基酸(Arg15Ala、His447Ala、Thr462Ala和His447Ala/Asp450Ala)突變后，GLU不能再與生淀粉結合。在GLM中部分氨基酸也很保守(Arg15、His444、Asp447、Thr459和Phe461)[47]，將GLM的His444和Asp447突變為Ala后，GLM結合生淀粉的能力下降，說明這一位點對結合生淀粉具有重要作用[62]。

3 扣囊復膜酵母對白酒風味物質的影響

扣囊復膜酵母的代謝物對白酒香型、風味的形成具有一定作用，其代謝譜與菌株[63-65]、酶活力[66]、培養基成分[67]及培養時間[67]有關。當碳源為葡萄糖時，主要的揮發性代謝物包括2-苯乙醇、2-乙酸苯乙酯和苯乙酸乙酯，這些均為苯丙氨酸衍生物，呈果香或花香；主要的非揮發性代謝物包括3種碳水化合物(甘露糖、阿拉伯醇、甘露醇)、4種脂肪酸(丙酸、軟脂酸、硬脂酸、肉豆蔻酸)、2種有機酸(草酸、琥珀酸)和8種氨基酸(異亮氨酸、絲氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸)[67]。當培養基為高粱時，代謝物包括9種酯類、5種內酯類、7種醇類、9種萘酚類、7種酸類和4種醛酮類化合物，其中6種化合物(苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醛、4-乙基愈創木酚、3-甲基丁酸和苯乙酸)為牛欄山二鍋頭白酒的重要生香成分[63]。

在米根霉、釀酒酵母中加入扣囊復膜酵母混合發酵可提升酒中總酸和氨基態氮的含量，同時大幅減少酒中的有害醇(甲醇、異丁醇、異戊醇)和總高級醇的含量，從而改善酒的品質。推測其原因，可能是由于扣囊復膜酵母菌株無法將丙酮酸高效轉化為乙醇，轉而生成乳酸和乙酸等，間接抑制了高級醇的生成。除丁酸乙酯，其他酯類(乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯)和總低級酯在混合發酵中均有增加，使酒的風味得到改善[66]。

4 展望

目前關于扣囊復膜酵母中的主要水解酶系和代謝譜已有大量研究，全基因組的公布也為進一步開發利用該物種提供了參考。鑒于扣囊復膜酵母的功能特性，未來還可通過對組學數據的進一步分析和分子生物學研究，闡明其在白酒發酵過程中的代謝通路調控，以及與其他白酒微生物的互作關系。此外，還需確定不同風味白酒釀造中適應不同工藝和發酵條件的扣囊復膜酵母菌株遺傳多樣性及其在生理、功能上的差異，從而為實際生產中篩選優良菌株，改良白酒品質提供參考依據。