高產光學純(R)-乙偶姻工程菌株的構建與發酵工藝優化*

馬志林，陳先銳，葉柳健，李檢秀，黃艷燕，張云開，蒙健宗**

(1.廣西大學生命科學與技術學院，亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣西南寧 530004；2.廣西科學院，國家非糧生物質能源工程技術研究中心，非糧生物質酶解國家重點實驗室，廣西生物質工程技術研究中心，廣西生物煉制重點實驗室，廣西南寧 530007)

0 引言

乙偶姻(Acetoin,AC)，化學品名為3-羥基-2-丁酮，又名3-羥基丁酮或甲基乙酰甲醇，具有強烈的奶油、脂肪、黃油樣香氣，是多種天然食品和發酵食品的重要風味物質。我國標準GB 2760—2014規定乙偶姻為允許使用的食用香料，FEMA安全號是2008[1-3]。而且，乙偶姻作為一種重要的四碳平臺化合物，已經被美國能源部指定為優先開發的平臺化合物之一，在食品、化工、醫藥、煙草、化妝品、調酒等行業具有廣泛的用途[4-5]。乙偶姻具有(R)-乙偶姻和(S)-乙偶姻兩種旋光異構體，單一構型的(R)-乙偶姻在合成高附加值手性藥物中間體、化學中間體、液晶材料等方面具有重要應用，因此光學純(R)-乙偶姻的價值要遠遠高于混合型乙偶姻[3-4]。

目前生產乙偶姻的方法主要為化學合成法[6]和微生物合成法[7-14]?；瘜W合成乙偶姻產品中容易摻雜致癌致病化合物，限制了乙偶姻作為食品香精香料的使用。微生物合成的乙偶姻屬于天然香料，其市場價格要遠遠高于化學合成的產品。自然界能夠合成乙偶姻的微生物有很多，如粘質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、產酸克雷伯氏菌(Klebsiellaoxytaca)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)、多粘類芽孢桿菌(Paenibacilluspolymyxa)和部分芽孢桿菌屬(Bacillus)等[15-19]，但天然菌株往往合成乙偶姻的能力較弱、(R)-乙偶姻光學純度低或菌株具有致病性，不利于(R)-乙偶姻的微生物發酵生產，導致光學純(R)-乙偶姻的市場價格居高不下，極大地限制了其發展和應用。

近年來，選育和改造天然微生物合成乙偶姻取得較多的研究成果。Xu等[20]通過誘變篩選得到高產菌株B.subtilisTH-49，以葡萄糖為碳源得到乙偶姻產量46.9 g/L；Sun等[21]利用紫外及LiCl進行復合誘變后篩選得到S.marcescensH32，再以蔗糖為碳源進行補料分批發酵，乙偶姻產量能達到60.5 g/L。誘變育種隨機性較高，通過代謝工程手段對細胞合成(R)-乙偶姻進行定向改造逐漸成為研究的主流。Bai等[22]和Lv等[23]分別對菌株S.marcescens進行遺傳操作，通過敲除meso-2,3-丁二醇脫氫酶基因slaC，或過量表達轉錄調控因子基因slaR，使其具有利用蔗糖生產(R)-乙偶姻的能力，產量分別為21.8 g/L和39.9 g/L；Wang等[24]敲除K.pneumoniaeCGMCC 1.6366的2,3-丁二醇脫氫酶編碼基因budC，可阻斷菌株將乙偶姻轉化為2,3-丁二醇；進一步敲除乙偶姻脫氫酶編碼基因acoABCD，工程菌株利用葡萄糖在補料發酵條件下生產(R)-乙偶姻可達62.3 g/L，光學純度為98.0%。大腸桿菌Escherichiacoli屬于非致病菌株，并且其本身不合成乙偶姻，因此有利于定向改造成生產光學純(R)-乙偶姻的工程菌株。Xiao等[25]在E.coliBL21(DE3)中過量表達來自B.subtilis的2,3-丁二醇脫氫酶基因ydjL(bdhA) 和來自Lactobacillusbrevis的NADH氧化酶基因noxE，以(2R,3R)-2,3-丁二醇為原料進行全細胞催化得到41.8 g/L(R)-乙偶姻，光學純度為96.0%；Xu等[3]克隆S.marcescens的budR、budA、budB基因以及L.brevis的NADH氧化酶基因，將其導入E.coliDH5α中進行表達，葡萄糖補料分批發酵的(R)-乙偶姻產量為60.3 g/L，光學純度為97.3%。

在微生物細胞中，α-乙酰乳酸合成酶(α-acetolactate Synthase，AlsS)和α-乙酰乳酸脫羧酶(α-acetolactate Decarboxylase，AlsD)是發酵丙酮酸生成(R)-乙偶姻的兩個關鍵酶。另外，糖酵解和三羧酸循環會產生大量的還原型輔酶NADH，而由丙酮酸到(R)-乙偶姻的合成并沒有消耗NADH，因此如果單一增強(R)-乙偶姻的合成會造成NADH累積，細胞將啟動各種雜醇雜酸合成途徑消耗過量的NADH來實現氧化型輔酶NAD+再生，必然會降低(R)-乙偶姻的合成效率和光學純度。本研究通過對細胞(R)-乙偶姻代謝途徑進行系統分析，利用輔酶工程精確調控異源NADH氧化酶進行合理表達來消耗胞內過量的NADH，使胞內NADH/NAD+氧化還原平衡，從而提高(R)-乙偶姻光學純度。以大腸桿菌E.coliMG1655為宿主細胞，將來源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE的核苷酸序列進行密碼子優化，利用人工合成的方法獲得包含3個基因的基因簇，構建表達質粒pTrc99A-budB-budA-noxE并導入大腸桿菌獲得工程菌株，達到提高目標產物轉化率和維持胞內NADH/NAD+氧化還原平衡的雙重目的，進一步優化工程菌的培養基成分和發酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體

宿主菌株E.coliMG1655和表達載體pTrc99A由作者所在實驗室保藏。

1.1.2 試劑

T4 DNA連接酶和各種限制性內切酶(NEB)；質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒和DNA純化試劑盒(Promega)；蛋白胨和酵母粉(OXOID，分析純)；葡萄糖、氯化鈉(分析純)、乙腈(國藥集團化學試劑有限公司，HPLC級別)；乙酸乙酯(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；乙偶姻(>98.0%)和2,3-丁二醇(>97.0%)(TCA)；氨芐(Amp,北京索萊寶科技有限公司)；甜菜堿(阿拉丁公司)；維生素B1(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.1.3 儀器

恒溫水浴搖床ZWY-110X50(上海智城分析儀器制造有限公司),生物傳感分析儀SBA-40D(山東省科學院生物研究所),3 L發酵罐(上海保興生物設備工程有限公司),旋轉蒸發器RE-5000(上海賢德實驗儀器有限公司),氣相色譜儀7890A(安捷倫科技有限公司),紫外可見光分光光度計DU800(美國貝克曼庫爾特公司),MIKRO 200離心機(德國Hettich科學儀器公司)。

1.1.4 培養基

種子培養基(LB培養基)：酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH值調至7.0，轉化子培養時添加氨芐0.1 g/L，固體培養基另加20 g/L瓊脂粉。

初始發酵培養基：葡萄糖80 g/L，酵母粉7 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉0.5 g/L，氨芐0.1 g/L，甜菜堿4 mmol/L，維生素B10.1 g/L，pH值調至7.0。

1.2 方法

1.2.1 產(R)-乙偶姻工程菌株的構建

將來源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE的核苷酸序列進行密碼子優化，在每個基因前面添加含核糖體結合位點和間隔序列TAAGGAGGATATACA連接成基因簇budB-budA-noxE，并由蘇州金唯智生物科技有限公司進行人工合成，利用酶切位點SacⅠ和BamHⅠ將基因簇budB-budA-noxE插入質粒pTrc99A的啟動子后面，獲得多順反子重組質粒pTrc99A-budB-budA-noxE，再將重組質粒pTrc99A-budB-budA-noxE轉化宿主菌E.coliMG1655；以含質粒pTrc99A的E.coliMG1655作為空白對照。分別挑取兩種轉化子提取質粒進行質粒酶切驗證、PCR驗證和測序驗證。

1.2.2 產(R)-乙偶姻工程菌株的發酵

將驗證正確的轉化子接到含Amp+的LB液體培養基中，37℃培養12 h，然后分別按照10%的接種量轉接于含有50 mL初始發酵培養基的三角瓶(250 mL)中，實驗組與對照組各3瓶，37℃，250 r/min，培養36 h。取發酵液，經離心機12 000 r/min離心2 min后，取上清液，經過稀釋一定倍數后測殘糖濃度以及(R)-乙偶姻含量。其中，(R)-乙偶姻得率為產物(R)-乙偶姻質量與消耗葡萄糖質量之比，生產強度為產物(R)-乙偶姻濃度與發酵周期之比。

1.2.3 產(R)-乙偶姻工程菌株發酵條件的優化

利用搖瓶發酵分別對葡萄糖濃度、酵母粉濃度、蛋白胨濃度、最佳接種量以及最適初始pH值進行單因素實驗，優化工程菌株發酵培養基和培養條件。

1.2.4 產(R)-乙偶姻工程菌株發酵罐補料發酵

優化初始發酵培養基后，將菌種接種于3 L發酵罐中，裝液量1.5 L，控制通氣量1.0 vvm，攪拌轉速500 r/min，溫度37℃。當殘糖濃度為30-40 g/L時補加葡萄糖至150-170 g/L，待發酵至殘糖濃度降到5-8 g/L時停止發酵。

1.2.5 殘糖濃度的檢測

取發酵液12 000 r/min離心處理2 min，取上清液稀釋100倍后，用生物傳感分析儀SBA-40D檢測殘糖濃度。

1.2.6 乙偶姻以及2,3-丁二醇濃度的檢測

使用氣相色譜儀測定乙偶姻和2,3-丁二醇的濃度。色譜柱為Phenomenex ZB-WAXplus毛細管色譜柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)，進樣口溫度和檢測器溫度均為250℃，使用內標法并以乙腈作內標來進行檢測。

1.2.7 (R)-乙偶姻光學純度的測定

采用氣相色譜儀測定(R)-乙偶姻的光學純。色譜柱為Agilent Cyclosil-B毛細管手性柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；FID氫火焰檢測器，載氣為氮氣，流速1.6 mL/min。起始柱溫度100℃，保留1 min，然后以10℃/min的速度升溫至120℃，以6℃/min的速度升溫至130℃，以20℃/min的速度升溫至230℃，進樣口溫度和檢測器溫度均為240℃，以乙酸乙酯為萃取劑。

2 結果與分析

2.1 產(R)-乙偶姻工程菌株GXASR的構建與發酵

將合成的基因簇budB-budA-noxE亞克隆至表達載體pTrc99A，構建重組質粒pTrc99A-budB-budA-noxE，將重組質粒轉化E.coliMG1655，轉化子提取質粒進行質粒酶切、PCR條帶電泳及DNA測序結果均驗證正確，證明工程菌株構建成功，命名為GXASR。同時本研究在各個基因前引入RBS序列來增強與核糖體間的親和力，提高蛋白翻譯效率[26]，以此來提高α-乙酰乳酸脫羧酶、α-乙酰乳酸合成酶以及氧化還原酶的表達，調控代謝流，以增加(R)-乙偶姻產量。

將對照菌株與工程菌株GXASR進行搖瓶培養，36 h后發酵結束，對發酵液進行檢測，對照菌株發酵液中沒有檢測到(R)-乙偶姻產生，工程菌株GXASR能夠有效地合成(R)-乙偶姻(表1)。

表1 工程菌株GXASR在初始培養基中的發酵

Table 1 Fermentation performances of engineering strain GXASR in initial medium

菌種Strains殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of(R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產強度Productivity(g/(L·h))MG1655/pTrc99A74.10±0.77NDND--GXASR0.0026.5±0.632.49±0.550.330.73

注：ND表示未檢測到

Note:ND means not detected

2.2 產(R)-乙偶姻工程菌株GXASR發酵條件優化

2.2.1 葡萄糖濃度對GXASR工程菌株合成(R)-乙偶姻的影響

工程菌株GXASR在葡萄糖濃度80-120 g/L范圍內，隨著碳源濃度的升高，(R)-乙偶姻產量也隨著提高。但是，隨著碳源濃度的升高，培養基變得更加黏稠使得傳質效率變低，且較高的碳源濃度，使得菌體所受的滲透壓變得更大，不利于菌體生長以及產物的合成。當葡萄糖濃度>100 g/L時，發酵周期明顯延長，并且殘糖濃度較高，乙偶姻產量提高幅度較小而副產物2,3-丁二醇濃度提高幅度較大(表2)，從發酵周期、葡萄糖利用程度、乙偶姻產量、副產物生成量以及生產強度綜合考慮，將發酵培養基碳源濃度定為100 g/L。

表2 葡萄糖濃度對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 2 Effect of glucose concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

葡萄糖濃度Concentration of glucose (g/L)發酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產強度Productivity(g/(L·h))80360.35±0.0326.10±0.862.17±0.340.330.7390380.43±0.0828.44±0.772.31±0.250.320.75100406.60±0.7330.49±0.823.54±0.460.330.761104816.47±0.8431.16±0.619.10±0.380.330.651205429.40±0.6133.24±0.6412.24±0.770.370.62

2.2.2 蛋白胨濃度對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

工程菌株GXASR在蛋白胨濃度為15 g/L時，(R)-乙偶姻濃度、得率、生產強度都達到了最大；當蛋白胨濃度超過15 g/L時，(R)-乙偶姻合成效率反而變低，得率以及生產效率也跟著下降(表3)，這可能是由于蛋白胨濃度不斷變高，使得氮源濃度過高導致營養富余，菌體將多余的營養物質用于合成自身所需的其他物質，從而致使(R)-乙偶姻合成效率低下，故將發酵培養基蛋白胨濃度定為15 g/L。

表3 蛋白胨濃度對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 3 Effect of peptone concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

蛋白胨濃度Concentration of peptone (g/L)發酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產強度Productivity(g/(L·h))5.0367.73±0.2528.01±0.260.98±0.130.300.787.5366.73±0.4329.73±0.171.21±0.060.320.8310.0361.73±0.3632.41±0.821.48±0.220.330.9012.5363.67±0.5433.31±0.611.62±0.040.350.9315.0366.23±0.6134.05±0.051.56±0.140.360.9517.5363.63±0.7133.48±0.881.62±0.250.350.9320.0368.97±0.8331.27±0.341.39±0.300.340.87

2.2.3 酵母粉濃度對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

酵母粉濃度為15 g/L時，(R)-乙偶姻濃度、得率和生產強度最高；隨著酵母粉濃度繼續增大，3項指標都略有下降(表4)，這是由于菌株將富余的營養物質以及能量用于副產物的合成，從而降低(R)-乙偶姻合成效率，因此將發酵培養基酵母粉濃度定為15 g/L。

表4 酵母粉濃度對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Table 4 Effect of yeast extract concentration on (R)-acetoin produced by engineering strain GXASR

酵母粉濃度Concentration of yeast extract (g/L)發酵周期Fermentation time (h)殘還原糖濃度Concentration of residual sugar (g/L)(R)乙偶姻濃度Concentration of (R)Acetoin (g/L)2,3丁二醇濃度Concentration of 2,3BD (g/L)得率Yield (g/g)生產強度Productivity(g/(L·h))5.0367.45±0.3230.74±0.581.91±0.030.310.857.5361.70±0.5332.68±0.832.71±0.210.330.9010.0362.83±0.6633.00±0.802.43±0.330.340.9212.5362.55±0.8234.36±0.242.86±0.540.370.9515.0360.20±0.1035.51±0.332.85±0.180.380.9917.5363.77±0.7535.13±0.222.52±0.390.370.9820.0360.27±0.1635.01±0.673.11±0.260.350.97

2.2.4 發酵初始pH值以及接種量對工程菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

pH值為6.0-7.5時，工程菌株耗糖效率均比較好，殘糖濃度小于10 g/L，當pH值為6.5時，菌株的(R)-乙偶姻產量最高(圖1)。首先菌株在pH值為7.0的種子培養基中培養后，轉接到pH值為6.5的發酵培養基中，由于pH值相近，菌種很容易適應pH值的變化；其次菌種在發酵過程中會產生有機酸，培養基會呈現弱酸性的趨勢，選擇pH值為6.5的發酵條件，在發酵過程中不需要補加過多的堿以維持培養基呈中性，減少了堿液對發酵過程的影響。接種量為10%時菌株耗糖效率最快、(R)-乙偶姻產量最高。接種量過低，菌種增殖速度慢，(R)-乙偶姻產量不理想；而接種量過高，菌種增殖速度快，細胞生長額外消耗了較多的碳源，導致用于合成(R)-乙偶姻的葡萄糖減少，故(R)-乙偶姻不升反降(圖2)。因此，確定菌種最適發酵培養基pH值為6.5，最適接種量為10%。在優化的條件下搖瓶發酵(R)-乙偶姻產量為36.82 g/L，光學純為99.1%。

圖1 初始pH值對菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Fig.1 Effect of initial pH value on (R)-acetoin produced by GXASR

圖2 接種量對菌株GXASR合成(R)-乙偶姻的影響

Fig.2 Effect of inoculate volume on (R)-acetoin produced by GXASR

2.3 工程菌株GXASR發酵罐補料發酵

經過發酵條件的優化，確定以100 g/L葡萄糖為碳源、15 g/L蛋白胨和15 g/L酵母粉為氮源的發酵培養基，pH值為6.5以及接種量10%進行3 L發酵罐補料發酵實驗。在發酵過程中的不同時間點進行取樣，檢測發酵液菌體濃度、(R)-乙偶姻濃度、2,3-丁二醇濃度以及殘糖濃度。當殘糖濃度降至30-40 g/L時一次補加葡萄糖至160 g/L。發酵初期菌體OD600增長迅速，耗糖較快，發酵7.5 h時殘糖濃度降低到40.2 g/L，菌體OD600達17.4，此時菌體濃度高、代謝活力強，通過補加葡萄糖，細胞可以高效合成(R)-乙偶姻，發酵液中(R)-乙偶姻濃度快速升高。發酵36 h時，殘糖濃度降至8.5 g/L，發酵液中(R)-乙偶姻濃度不再增加，發酵結束，(R)-乙偶姻產量達到67.65 g/L，生產強度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g(圖3)。

圖3 工程菌株GXASR補料發酵

Fig.3 The fed-batch fermentation of engineering strain GXASR

3 討論

化學法及天然菌種產生的乙偶姻都是(R)-乙偶姻和(S)-乙偶姻的混合物，兩者的物理化學性質相近，手性拆分十分困難，存在高成本、高能耗、污染嚴重等問題，極大地限制了光學純(R)-乙偶姻開發和應用。因此，開展微生物代謝網絡改造及高效生產光學純(R)-乙偶姻的研究具有重要的意義，也是近年來研究熱點之一。Kochius等[27]利用酶催化氧化meso-2,3-丁二醇的方法合成(R)-乙偶姻，濃度為48 mmol/L，反應需要的輔酶NAD+由電化學方法再生；2016年，Guo等[28]在E.coliBL21(DE3)中表達meso-2,3-丁二醇脫氫酶、NADH氧化酶和血紅蛋白的基因，將獲得的E.coli/pET-mbdh-nox-vgb作為全細胞生物催化劑，可以高效催化meso-2,3-丁二醇還原為(R)-乙偶姻，(R)-乙偶姻的產量為86.7 g/L，光學純度為97.9%。但全細胞催化法需要采用meso-2,3-丁二醇、(R,R)-2,3-丁二醇等作為底物，光學純的底物成本高昂，無法應用于工業生產(R)-乙偶姻。有相當多的報道[3,22-25]通過合成生物學方法和代謝工程方法在微生物細胞中高效表達(R)-乙偶姻合成的關鍵酶基因或敲除(R)-乙偶姻降解的相關基因，對菌株進行代謝網絡改造，采用葡萄糖、蔗糖等碳源合成(R)-乙偶姻，其產量和光學純度都有較大的提高。但是工程菌株中代謝網絡的碳架物質流量往往會發生重大改變，導致(R)-乙偶姻合成與細胞內氧化還原平衡關系的失調，進而限制(R)-乙偶姻產量和光學純度的進一步提高，(R)-乙偶姻光學純度通常在98%以下。大腸桿菌遺傳背景清晰、轉化效率高、遺傳操作技術成熟，使其在代謝工程等研究領域備受青睞，是用于構建微生物細胞工廠合成生物基化學品首選宿主之一。本研究以大腸桿菌E.coliMG1655為宿主細胞，將來源于E.cloacae的α-乙酰乳酸合成酶基因budB、α-乙酰乳酸脫羧酶基因budA和來源于L.brevis的NADH氧化酶基因noxE組成基因簇，構建大腸桿菌生產(R)-乙偶姻工程菌株，實現大腸桿菌高效合成(R)-乙偶姻和胞內NADH/NAD+氧化還原平衡，通過優化發酵過程，經搖瓶發酵的(R)-乙偶姻產量為36.82 g/L，光學純度高達99.1%，發酵罐補料發酵的(R)-乙偶姻產量達到67.65 g/L，生產強度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g，發酵周期短，生產強度高，是具有潛力的(R)-乙偶姻生產方法。

同時在研究中發現，以葡萄糖、酵母粉和蛋白胨等作為原料時成本仍較高，在大規模發酵生產時不利于提高效益；發酵過程中隨著(R)-乙偶姻的積累，會出現2,3-丁二醇、乙醇、乳酸、乙酸等副產物的產出，副產物濃度升高時會降低目的產物的轉化率并導致生物毒性，對菌體的生長速率、菌體濃度以及外源基因表達都會產生明顯的抑制作用。本研究下一步將探討利用廉價原料替代高價碳源氮源，并通過代謝工程、基因組學等手段對細胞內(R)-乙偶姻的合成和分解代謝網絡進行系統解析與優化，為低成本、高效率生產高光學純(R)-乙偶姻提供操作性良好的技術支持。

4 結論

本研究成功構建了產光學純(R)-乙偶姻的大腸桿菌工程菌株GXASR，并通過搖瓶發酵對發酵培養基和培養條件進行優化，使得工程菌株GXASR能高效地合成(R)-乙偶姻。GXASR工程菌株在優化后的培養基以及發酵條件中，經搖瓶發酵的(R)-乙偶姻產量為36.82 g/L，通過發酵罐補料發酵36 h，(R)-乙偶姻產量能夠達到67.65 g/L，光學純為99.1%，生產強度為1.88 g/(L·h)，得率為0.40 g/g，顯著提高了(R)-乙偶姻合成效率。本研究為人工途徑合成(R)-乙偶姻提供了現實指導意義。