捕撈應激對團頭魴不同組織中Nrf2-Keap1信號通路相關基因表達的影響

趙振新， 楊明舉， 張顯波， 趙 鳳， 楊 星， 趙 飛， 劉 偉

(1.貴州省農業科學院 水產研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產工程技術中心, 貴州 貴陽 550025)

魚類的應激反應(Stress response)是指魚類對超過其正常生活范圍的異常因素刺激所產生的一種非特異性生理反應，包括初級應激反應(血液中皮質類膽固醇和茶酚胺類物質濃度升高)和次級應激反應(代謝與機能的改變，如器官組織應激損傷，肝組織糖原含量變化等)[1]。應激反應對動物機體健康具有雙重作用，過度或過長的應激對機體產生危害，適當的應激可增強機體的適應能力，不同的應激反應在生產中被分別予以預防和利用[2]。在魚類養殖、捕撈、運輸等過程中會對魚體產生不同程度的應激作用，嚴重時可引起魚類行為異常、皮膚滲透性增強、食欲下降、生殖力降低、生長受到抑制、抵抗力下降甚至死亡等[3]。如黃顙魚運輸過程中，第0～3天的皮質醇含量明顯高于第7～35天，在第7天時血清皮質醇含量明顯減少[4]。陳鵬飛等[5]研究擁擠脅迫對苗王云鯽的影響時發現，脅迫第3天魚體內的皮質醇和血糖含量均達最大值，此后含量緩慢下降，30 d后維持正常水平。因此，研究魚類應激反應特點可有效降低水產養殖過程各種應激源對魚體生長健康和存活率的影響有重要的指導作用。

團頭魴(Megalobramaamblycephala)俗稱武昌魚，隸屬硬骨魚綱，鯉形目，鯉科，鮊亞科，魴屬。團頭魴是我國大宗淡水養殖魚類之一，具有養殖成本低、生長快、規格適中、含肉率高等優點，被作為優良的淡水養殖品種在全國推廣[6-7]。由于團頭魴對環境的應激比較敏感[8]，生產中捕撈、養殖密度改變等產生的應激均會嚴重影響其生長發育和存活率。目前關于團頭魴應激反應的研究已有諸多報道，如密度、藥物應激[9-10]等，但關于捕撈應激相關研究卻鮮見報道。因此，筆者等研究捕撈應激對團頭魴體內不同組織器官產生氧化應激過程中Nrf2-Keap1信號通路相關基因的表達情況，以期從機理上了解捕撈對團頭魴產生應激反應的變化情況，從而為其水產健康養殖及免疫防控技術的研究提供理論支撐。

1材料與方法

1.1材料

團頭魴由中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉漁場提供，150 g左右，體質健康無傷。飼養于循環水系統中，飼料為通威股份無錫分公司顆粒飼料(粗蛋白:32%)。試驗中所需的團頭魴基因全長序列NOX2、Nrf2、Keap1、Bach1、CAT和SOD從中國水產科學研究院淡水漁業研究中心水產病害與飼料研究室的團頭魴基因組數據庫中所得。

1.2試驗設計

試驗采用單因素設計。挑選12尾體量為(150±0.35)g健康充滿活力的團頭魴，在室內循環水槽中飼養3周，每天投喂3次(8:20-9:00、11:30-12:10和16:50-17:30)，飽食。飼養期間循環水系統日夜連續循環并充氣增氧，飼養溫度(26±1)℃，pH 7.2～7.8，DO>6 mg/L，H2S<0.01 mg/L，光照周期為光照∶黑暗=14 h∶10 h。保持室內安靜以避免對魚產生驚擾應激。

采樣前將魚停食24 h，并將水槽內水深降至10 cm，迅速用抄網將魚全部撈出，并在空氣中暴露5 min后放入事先備好的MS-222(濃度為100 mg/L)中做快速深度麻醉，取魚鰾(S-B)、肝臟(L)、腎臟(K)、腸道(I)、心臟(H)、肌肉(M)、腦(B)、脾臟(S)及頭腎(H-K)等組織用液氮速凍后于-80℃保存，用于分子生物學測定。

1.3引物的設計與合成

引物根據團頭魴Nrf2、Keap1和Bach1基因序列及內參基因β-actin (GeneBank Accession No. AY170122.2)設計[11](表1)。

表1 團頭魴Nrf2、Keap1和Bach1基因熒光定量PCR引物

1.4cDNA的提取

根據楊震飛等的方法[9]，按照TaKaRa公司的RNAiso Plus試劑盒說明書分別提取腸道、肝臟、魚鰾等組織的總RNA，并通過電泳檢測RNA的完整性，一般OD260/280為1.8～2.0。并以DNAase I處理過的RNA及RT液為模板，確定處理過的樣品RNA中無DNA污染。最后，采用TaKaRa Prime Script?RT reageat Kit反轉錄試劑盒合成cDNA，并置于—20℃保存待用。

1.5SYBR Green I Real Time PCR反應

各組織中Nrf2、Keap1和Bach1相對表達水平的確定采用崔素麗[12]的方法。在熒光定量擴增效率一致的前提下，使用β-actin對測定的Ct值做均一化處理，以對照組中mRNA為基準，用2-ΔΔCt法獲得基因相對表達量。

1.6數據處理

采用Duncan對試驗數據進行多重比較，在單因素方差分析基礎上利用SPSS 20.0檢驗各試驗組數據的差異性。

2結果與分析

2.1捕撈應激團頭魴不同組織中3種基因的表達量

Nrf2-Keap1信號通路中相關基因的表達結果(圖1)顯示，當團頭魴受到捕撈應激后，腸道和肝臟中的氧化應激表現最激烈，Nrf2、Keap1和Bach1基因均出現極顯著的表達上調。但魚鰾、腎臟、心臟、肌肉、腦、脾臟及頭腎中的基因表達量無顯著變化，表明，捕撈應激反應主要集中在肝臟和腸道中。

注：不同小寫字母表示不同組織間基因表達差異顯著(P<0.05)。

Note: Different lowercase letters indicate significance of difference in gene expression among different tissues atP<0.05 level.

圖1 捕撈應激團頭魴不同組織中Nrf2 、Keap1和Bach1 基因的表達量

Fig.1 Expression ofNrf2,Keap1 andBach1 gene in different tissues ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

2.2捕撈應激團頭魴肝臟和腸道Nrf2-Keap1信號通路

從圖2看出，在魚體受到捕撈應激時，肝臟和腸道中的組織細胞會產生應激反應，從而激活呼吸爆發相關活性酶產生ROS，過多的ROS激活Nrf2和Keap1，促使Nrf2與Keap1分離進入細胞核，然后與細胞核中的Bach1相互作用產生細胞因子激活SOD、CAT等抗氧化酶，而抗氧化酶會消除細胞內過多的ROS，以減少捕撈應激所帶來的損傷。

圖2 捕撈應激團頭魴肝臟和腸道細胞中Nrf2-Keap1的信號通路

Fig.2 Signal channel of Nrf2-Keap1 in liver and intestinal cell ofM.amblycephalaunder rapid fishing stress

3結論與討論

應激是一種反應模式，是指動物機體受到外界或內部不良因素刺激后，所產生的一系列非特異性應答反應[13-14]。但同一種刺激對機體不同組織所造成的應激反應有所不同。商振達等[15]研究得出，饑餓應激對不同部位肌肉的糖酵解指標和品質指標有不同程度的影響，其中饑餓應激對股二頭肌的糖酵解指標和品質指標影響最大。YANG等[16]研究發現，高密度養殖團頭魴，其產生的應激可導致腸道產生氧化應激損傷，但對肌肉和腦卻不會產生相應的傷害。研究表明，捕撈所產生的應激對腸道和肝臟產生較明顯的影響，顯著促進組織細胞中呼吸爆發活性，從而激活抗氧化信號通路Nrf2-Keap1中相關基因的活性，但對于腦、腎臟、肌肉等組織卻無顯著影響。表明，捕撈所產生的瞬時應激反應主要集中在肝臟和腸道中。

應激可直接或間接促進生物體內ROS生成，而ROS可與組織的細胞膜、蛋白質及核酸分子發生氧化還原反應，發揮殺菌作用，參與宿主細胞的免疫。在此過程中細胞質中的 NADPH 氧化酶(NOX)會轉移到細胞膜，與膜上的NADPH結合產生超氧陰離子(O2-)，最后轉換成ROS[17-18]。然而，過量的ROS會引發細胞的氧化損傷，阻礙生物體的生長和發育[19]。研究表明，捕撈所產生的應激反應顯著促進了肝臟和腸道細胞中Nrf2、Keap1和Bach1基因的表達，說明短暫的瞬時應激已經激活了肝臟和腸道內抗氧化應激反應，從而使抗氧化系統開始發生反應，抵抗應激所帶來的傷害。徐蕾[20]研究也得出，短期饑餓應激便可導致翹嘴鱖腸道發生強烈的氧化應激反應，氧化應激相關基因表達量也顯著增加。鄧悅[21]研究發現短暫的氧化應激可引起大鼠內耳發生氧化損傷，從而導致聽覺器官損傷。

短暫的捕撈應激中，腦、肌肉、腎臟等組織中的Nrf2、Keap1和Bach1 m RNA 表達量沒有出現上調，在食蚊魚的研究中應激初期也有類似的結果[22]。在大黃魚鋅的急性氧化應激初期試驗中，Nrf2-Keap1相關基因的表達量同樣沒有顯著上調[23]。說明，捕撈所產生的應激強度較小且短暫，未對團頭魴機體整體抗氧化防御系統造成大的影響，機體處于可調節的動態平衡中。但如果持續的、高強度的捕撈應激，可能會影響抗氧化應激能力，導致機體發生氧化應激損傷，相關研究還有待進行。