不同葉齡組織庫拉索蘆薈對6種典型致病細(xì)菌的抑菌效果

王 斌， 張騰霄， 張春華， 趙洪波， 劉旭陽

(綏化學(xué)院 食品與制藥工程學(xué)院， 黑龍江 綏化 152061)

蘆薈中含有蒽醌、多糖、多肽、活性酶和有機(jī)酸等天然活性成分，具有抗菌、抗病毒、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤等活性，廣泛用于保健食品、傳統(tǒng)醫(yī)藥、美容品中[1-2]。蘆薈中蒽醌化合物具有較強(qiáng)的廣譜抑菌效果，且對易產(chǎn)生耐藥性的葡萄球菌和鏈球菌最敏感，有關(guān)蘆薈抑菌研究主要涉及臨床用藥[3-13]、畜禽養(yǎng)殖[14-15]、大田作物栽培[16-17]、食品防腐[18-19]等。金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌和陰溝腸桿菌不但會導(dǎo)致畜禽疾病，而且是人類食源性致病菌，困擾著人類的健康和養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。在食品防腐中，合成防腐劑和添加劑對人體健康存在隱患，發(fā)現(xiàn)和開發(fā)新型天然抗菌劑符合當(dāng)前食品安全需求。蘆薈生長過程中嫩葉不斷從中心抽生但老葉并不凋落，相關(guān)研究表明不同葉齡的蘆薈葉片中代謝積累成分不同，其功能也有所差別。目前，鮮見有關(guān)不同葉齡組織蘆薈葉片功能的研究報(bào)道。為此，筆者等采用藥敏紙片法和二倍稀釋法，比較不同葉齡組織庫拉索蘆薈對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌、陰溝腸桿菌等常見致病菌的抑菌效果，以期為庫拉索蘆薈在醫(yī)藥、養(yǎng)殖、食品防腐等方面的深度開發(fā)提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

庫拉索蘆薈： 6年生蘆薈，產(chǎn)于黑龍江省綏化市。經(jīng)綏化學(xué)院鑒定為庫拉索蘆薈(AloebarbadensisMiller)。

陽性對照品：硫酸慶大霉素膠囊(重慶迪康長江制藥有限公司)，氯霉素滴眼液(長春迪瑞制藥有限公司)，紅霉素腸溶片(江蘇平光制藥有限責(zé)任公司)，蘆薈膠制劑(蘆薈膠含量為96%，廣州廣德堂藥業(yè)有限公司)。

革蘭氏陽性菌：金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)。革蘭氏陰性菌：大腸桿菌(Escherichiacoli)、銅綠假單胞菌(P.Aeruginosa)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、陰溝腸桿菌(Enterobactercloacae)，均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

試劑：乙醇、蒸餾水、NaCl、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、葡萄糖，均為分析純。

儀器：FA2104電子天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，SW-CJ-2F雙人雙面凈化工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)，YXQ-LS-50SII型立式壓力蒸汽滅菌器(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，HPX-9162MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，BCD-209KHC冰箱(中科美菱低溫科技股份有限公司)，KQ-50B型超聲波清洗器(南京科立華儀器儀表有限公司)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基制備大腸桿菌、銅綠假單胞菌、腸炎沙門氏菌、單增李斯特菌培養(yǎng)基配方：牛肉膏 3.0 g、蛋白胨 10.0 g、NaCl 5.0 g、瓊脂 20.0 g和 H2O 1 000 mL。金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基配方：牛肉膏1.5 g、蛋白胨 5.0 g、NaCl 40.0 g、瓊脂 10.0 g和 H2O 500 mL。陰溝腸桿菌培養(yǎng)基配方：牛肉膏5.0 g、蛋白胨 5.0 g、NaCl 2.5 g、瓊脂 10.0 g、葡萄糖5.0 g和 H2O 500 mL。上述培養(yǎng)基按配方配置后分裝、滅菌(121℃，20 min)、倒平板，置于超凈工作臺備用。

1.2.2菌懸液制備將4℃冰箱保存的6種供試菌分別轉(zhuǎn)接在相應(yīng)平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌落分別用接種環(huán)刮取2～3環(huán)放入裝有滅菌生理鹽水錐形瓶中，搖床(200 r/min)上振搖10 min得菌懸液，按麥?zhǔn)媳葷峁芊▽⒕鷳乙旱木鷿舛认♂屨{(diào)整為1×106cfu/mL，置超凈工作臺中備用。

1.2.3樣品液制備樣品共24個(gè)：樣品A，嫩葉皮+凝膠；樣品B，嫩葉凝膠；樣品C，中葉皮+凝膠；樣品D，中葉凝膠；樣品E，老葉皮+凝膠；樣品F，老葉凝膠。樣品A～F均按濃度100%、75%、50%和25%進(jìn)行配置。配置方法：分別用蒸餾水、無菌水清洗庫拉索蘆薈葉表面。稱取其老葉(生長底部)、中葉(生長中部)、嫩葉(生長上部)的皮+凝膠及凝膠各10 g，充分研磨，得原液(濃度100%)。用無菌水稀釋分別得到濃度為75%、50%、25%的樣品液，置于超凈工作臺中用于測定抑菌活性。

1.2.4濾紙片法抑菌活性測定在超凈工作臺中分別用移液槍吸取0.2 mL不同菌懸液，均勻涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基平板上。將無菌濾紙片在樣品液中浸泡0.5 h。用無菌鑷子夾取濾紙片，淋掉多余液體，使濾紙片與培養(yǎng)基密切接觸。每個(gè)培養(yǎng)平板均勻放置4張濾紙片。滅菌生理鹽水為陰性對照，抗生素(H為紅霉素、Q為硫酸慶大霉素、L為氯霉素、及Y為蘆薈膠制劑)為陽性對照。蘆薈膠制劑稀釋成與樣品液相同的4個(gè)濃度。將培養(yǎng)基置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)24 h。測定其抑菌圈直徑(mm)，平行3次，抑菌圈直徑用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過預(yù)試驗(yàn)確定，0.13 mg/mL紅霉素(H)為金黃色葡萄球菌陽性對照，5 mg/mL氯霉素(L)為單增李斯特菌的陽性對照，0.8 mg/mL硫酸慶大霉素(Q)為革蘭氏陰性菌陽性對照。并在此基礎(chǔ)濃度上按75%、50%、25%稀釋，濾紙片法測定各陽性對照品4個(gè)不同濃度對試驗(yàn)菌株的抑菌活性，篩選所需的陽性對照品所用的抗菌藥品及濃度，具體操作同樣品測定。

1.2.5最小抑菌濃度測定采用二倍稀釋法，參照文獻(xiàn)[15]和[20]方法測定最小抑菌濃度：將1.2.3步驟制備的蘆薈樣品原液以有效成分為1.0 g/mL計(jì)，用液體培養(yǎng)基將各蘆薈樣品原液(濃度100%)稀釋成二倍比的系列試管，各試管濃度分別為0.50 g/mL、0.25 g/mL、0.125 g/mL、0.062 5 g/mL、0.031 3 g/mL、0.015 6 g/mL、0.007 8 g/mL、0.003 9 g/mL、0.002 0 g/mL和0.001 0 g/mL，再向各試管中加入0.1 mL含 1×106CFU/mL 的菌懸液，試管置于 37℃恒溫培養(yǎng) 24 h，觀測最小抑菌濃度(MIC)。

2結(jié)果與分析

2.1不同葉齡組織庫拉索蘆薈的抑菌效果

2.1.1金黃色葡萄球菌從圖1可知，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠部分(100%濃度)對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，且葉齡間抑菌效果接近。嫩葉皮+凝膠、中葉皮+凝膠和老葉皮+凝膠的抑菌圈直徑分別是(28.1±0.53)mm、(28.2±0.53)mm、(28.4±0.53)mm，與陽性對照品0.13 mg/mL紅霉素抑菌效果接近，高于蘆薈膠制劑。不同葉齡庫拉索蘆薈凝膠部分對金黃色葡萄球菌的抑菌效果是對應(yīng)葉齡其皮+凝膠的約1/3，且葉齡間差別不大。各樣品抑菌活性均隨樣品濃度降低而降低。

2.1.2單增李斯特菌從圖2可知，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠(100%濃度)對單增李斯特菌的抑菌效果略高于其凝膠(100%濃度)，但差異不大。且其抑菌活性稍高于蘆薈膠制劑，明顯低于陽性對照5 mg/mL氯霉素。各樣品對單增李斯特菌抑菌效果差異較小，其抑菌活性均隨樣品濃度降低而降低。

圖1 不同葉齡組織庫拉索蘆薈對金黃色葡萄球菌的抑菌活性

Fig.1 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstS.aureus

Fig.2 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstL.monocytogenes

2.1.3大腸桿菌從圖3可知，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠(100%濃度)對大腸桿菌的抑菌效果最好，且葉齡間抑菌效果接近。嫩葉皮+凝膠、中葉皮+凝膠和老葉皮+凝膠的抑菌圈直徑分別為(15.5±0.27)mm、(15.7±0.27)mm、(15.7±0.27)mm，與陽性對照0.8 mg/mL硫酸慶大霉素抑菌效果接近，高于蘆薈膠制劑。不同葉齡庫拉索蘆薈凝膠對大腸桿菌的抑菌效果比其對應(yīng)葉齡皮+凝膠的活性約低20%，且葉齡間差別不大。各樣品抑菌活性均隨著樣品濃度降低而降低。

2.1.4腸炎沙門氏菌從圖4可知，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠(100%濃度)對腸炎沙門氏菌的抑菌效果明顯高于其凝膠(100%濃度)，其抑菌活性略高于蘆薈膠制劑，明顯低于陽性對照0.8 mg/mL硫酸慶大霉素。同組織不同葉齡的蘆薈對腸炎沙門氏菌抑菌活性無明顯差異。皮+凝膠的抑菌活性均隨樣品濃度降低而降低。凝膠濃度100%和75%樣品的抑菌活性接近，但樣品濃度50%和25%無抑菌活性。

Fig.3 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstE.coli

圖4 不同葉齡組織庫拉索蘆薈對腸炎沙門氏菌的抑菌活性

Fig.4 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstS.enteritidis

2.1.5陰溝腸桿菌從圖5可知，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠(100%濃度)對陰溝腸桿菌的抑菌效果略高于其凝膠(100%濃度)，但差異不大。皮+凝膠(100%濃度)的抑菌活性略高于蘆薈膠制劑，明顯低于陽性對照0.8 mg/mL硫酸慶大霉素。同組織不同葉齡的蘆薈對陰溝腸桿菌抑菌活性無顯著差異。各樣品濃度100%和75%其抑菌活性接近，但所有25%濃度樣品均無抑菌活性。

Fig.5 Antibacterial activity ofA.barbadensistissue with different leaf age againstE.cloacae

2.2最小抑菌濃度

從表1可知，不同葉齡皮+凝膠樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和腸炎沙門氏菌的最小抑菌濃度分別均為0.007 8 g/mL、0.007 8 g/mL、0.062 5 g/mL和0.062 5 g/mL；不同葉齡凝膠樣品對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、單增李斯特菌和腸炎沙門氏菌的最小抑菌濃度分別均為0.015 6 g/mL、0.015 6 g/mL、0.250 0 g/mL和0.500 0 g/mL；各樣品對陰溝腸桿菌最小抑菌濃度均為0.250 0 g/mL。說明，不同葉齡組織蘆薈對供試菌的抑菌活性有差異，低濃度的蘆薈樣品對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用，其最小抑菌濃度為0.007 8 g/mL。而腸炎沙門氏菌和陰溝腸桿菌對蘆薈樣品敏感度低，只有高濃度的樣品才能發(fā)揮抑制作用。

表1 不同葉齡組織庫拉索蘆薈樣品對供試菌的最小抑菌濃度

Table 1 MIC ofA.barbadensistissue with different leaf age against tested bacteria

樣品編號Sample No.菌種 Bacteria最小抑菌濃度/(g/mL)MICA金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大腸桿菌(Escherichia coli)0.007 8腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0B金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大腸桿菌(Escherichia coli)0.015 6腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0C金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大腸桿菌(Escherichia coli)0.007 8腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0D金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大腸桿菌(Escherichia coli)0.015 6腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0E金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.007 8單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.062 5大腸桿菌(Escherichia coli)0.007 8腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.062 5陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0F金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)0.015 6單增李斯特菌(Listeria monocytogenes)0.250 0大腸桿菌(Escherichia coli)0.015 6腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)0.500 0陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)0.250 0

3結(jié)論與討論

庫拉索蘆薈樣品對供試菌有明顯的選擇抑制性，不同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，不同葉齡間抑菌活性接近，且最小抑菌濃度均為0.007 8 g/mL，樣品液(100%濃度)與陽性對照0.13 mg/mL紅霉素相近，優(yōu)于陽性對照蘆薈膠制劑，可能是蘆薈膠制劑中加入了維生素E及其他輔料從而降低了其抑菌效果。不同葉齡庫拉索蘆薈凝膠對大腸桿菌的抑菌效果最好，不同葉齡間抑菌活性接近，最小抑菌濃度均為0.007 8 g/mL，樣品液(100%濃度)抑菌效果略小于陽性對照0.8 mg/mL硫酸慶大霉素，與陽性對照蘆薈膠制劑相近。建議在開發(fā)抑制金黃色葡萄球菌的應(yīng)用時(shí)，結(jié)合生物學(xué)產(chǎn)量，選用中葉庫拉索蘆薈皮+凝膠；抑制大腸桿菌時(shí)，選用中葉庫拉索蘆薈凝膠。

研究表明，濃度大于50%的庫拉索蘆薈樣品對5種致病菌均有顯著的抑制作用，且濃度越高抑菌效果越好；皮加凝膠的抑菌效果明顯優(yōu)于凝膠的抑菌效果，但庫拉索蘆薈老葉、中葉、嫩葉的抑菌作用無顯著差別。同種蘆薈樣品對各種病菌抑制作用表現(xiàn)出選擇性差異，對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑制效果較突出，尤其是皮加凝膠原液對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌抑菌圈直徑均接近其對應(yīng)陽性對照(紅霉素和硫酸慶大霉素)。庫拉索蘆薈皮+凝膠抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌>大腸桿菌>腸炎沙門氏菌>單增李斯特菌>陰溝腸桿菌。庫拉索蘆薈凝膠抑菌效果依次為大腸桿菌>金黃色葡萄球菌>陰溝腸桿菌>單增李斯特菌>腸炎沙門氏菌。

蒽醌類化合物和凝膠多糖是蘆薈發(fā)揮抗菌作用的有效成分，且蒽醌類化合物的抗菌活性大于凝膠多糖由于蒽醌類化合物主要積累于蘆薈外皮中[21-23]，因此，同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠的抑菌效果明顯優(yōu)于凝膠的抑菌效果。

庫拉索蘆薈的外皮和凝膠均有優(yōu)良的抗菌作用且抗菌譜廣。從葉齡看，庫拉索蘆薈老葉、中葉、嫩葉抑菌效果無顯著差別。從組織看，同葉齡庫拉索蘆薈皮+凝膠的抑菌效果明顯優(yōu)于凝膠的抑菌效果，二者對銅綠假單胞菌均無抑菌效果。從抑菌敏感度看，庫拉索蘆薈皮+凝膠對金黃色葡萄球菌抑菌效果最好，凝膠對大腸桿菌的抑菌效果最強(qiáng)。說明，庫拉索蘆薈成為新型天然抗菌劑的潛力巨大。