補腎調經(jīng)方基于下丘腦-垂體-卵巢軸防治雷公藤多苷所致月經(jīng)不調機制研究＊

吳志明 ，史曉東 ，郭健 ，祝小波 ，徐衛(wèi)東 ，羅紅梅

（1.南昌大學第一附屬醫(yī)院中西醫(yī)結合科，南昌 330000；2.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院風濕病科，南昌 330000）

雷公藤多苷(tripterygium glycosides) 素有“中草藥激素”之稱，具有祛風除濕、解毒消腫、舒筋活絡、通過抑制細胞與體液免疫起到免疫抗炎等作用[1]。該藥對自身免疫系統(tǒng)疾病具有良好療效，臨床上常用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、血管炎及類風濕性關節(jié)炎等結締組織疾病[2]。中藥雷公藤有大毒，對消化系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、心腦血管系統(tǒng)及造血系統(tǒng)等具有明確的損害[3-5]，特別是女性生殖系統(tǒng)，雷公藤可抑制女性卵巢激素分泌等功能[6]，主要表現(xiàn)為月經(jīng)紊亂，如經(jīng)量減少或閉經(jīng)等，嚴重時出現(xiàn)卵巢早衰。本實驗通過檢測分析雷公藤多苷損害的幼年雌性大鼠性激素水平、卵巢與子宮指數(shù)、下丘腦-垂體-卵巢軸中多巴胺(DA)2 受體、5-HT2 受體 mRNA 及卵巢 Smad4 基因 mRNA表達，以探討中藥方劑補腎調經(jīng)方改善雷公藤多苷造成的藥源性月經(jīng)不調的部分機制。

1 材料與儀器

1.1 藥物與試劑 雷公藤多苷片，生產規(guī)格：10mg/片，由湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司制備，生產批號：20170138，批準文號：國藥準字 Z43020138。雌激素片，生產規(guī)格：0.625mg/片，由新疆新資源生物制藥有限責任公司制備，生產批號：20161208，批準文號：國藥準字H20090172。補腎調經(jīng)方為我科經(jīng)典方，組方為熟地黃15g、黨參15g、黃芪15g、當歸10g、菟絲子 10g、杜仲 10g、丹參 10g、益母草10g、淫羊藿 10g、肉蓯蓉 10g、川芎 10g，黃精 15g，巴戟天10g，五味子10g 甘草6g。此方劑中所有中藥飲片均由江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中藥房提供，并且配備有專業(yè)的藥劑師以確保方劑的藥物濃度及品質。煎煮藥物時，按照每100g 中藥飲片配比800ml 飲用水，按常規(guī)煎煮方法進行制備。其后，進行過濾收汁至生藥2.5g/ml 量，成品儲存于4℃恒溫冰箱之中。蒸餾水；生理鹽水；ELISA 試劑盒；原位雜交探針合成及原位雜交試劑盒，天津灝洋科技生物技術有限公司；RNA 提取試劑Trizol Reagent為Invitrogen 公司產品； 熒光定量 PCR 試劑盒購為大連TaKaRa 公司；Taq DNA 聚合酶、隨機引物等。

1.2 儀器 酶標儀(ThermoElectronCorporation,Type：354)；光學顯微(FA1104)；萬分之一分析天平(上海精科儀器有限公司 )； 數(shù)碼照相機VL-4s 型超凈臺，珠海市再鑫儀器有限公司；OLYMPUSBXS1，CH30 顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；實時熒光定量PCR 儀，美國ABI 公司。自動平衡離心機，湘儀離心機儀器有限公司；全自動酶標洗板機，匯松科技發(fā)展有限公司；多功能酶標分析儀，匯松科技發(fā)展有限公司；恒溫培養(yǎng)箱；紫外分光光度計為國產上海產品； 超低溫冰箱產于德國賀利氏公司；微量移液器產于德國Gilson 公司等。

1.3 動物 清潔級雌性 SD 大鼠，12 周齡，體重(250±10)g，每組 15 只。購自江西省實驗動物中心。購入動物后適應性喂養(yǎng)10d，連續(xù)10d 陰道涂片，選擇有正常動情周期的大鼠進行實驗，然后進行隨機分組。

2 方法

2.1 分組及模型制作 實驗大鼠根據(jù)隨機數(shù)字表法分為4 組，分別為模型對照組、補腎調經(jīng)組、雌激素組及正常對照組；模型制作：將1g 雷公藤多苷片溶于250 ml 生理鹽水配置為4mg/ml 溶液,按0.1ml/10g 體重灌胃,每日1 次，給藥劑量為臨床成人用量的30 倍,連續(xù)灌胃15d。

2.2 給藥方法及劑量 ⑴正常對照組：正常喂食，按0.1ml/10g 體重灌服生理鹽水,每日1 次,連續(xù)灌胃給藥12 周。⑵模型對照組：按0.1ml/10g 體重灌服雷公藤多苷片,每日1 次,連續(xù)灌胃給藥12 周。⑶補腎調經(jīng)組：造模成功后，按0.1ml/10g 體重灌服補腎調經(jīng)方,每日1 次,連續(xù)灌胃給藥12 周。⑷雌激素組：造模成功后，雌激素組按0.075mg/10g 體重的劑量進行灌胃，每日1 次,連續(xù)灌胃給藥12 周。

2.3 標本的采集與處理

2.3.1 各組大鼠末次給藥結束24h 后，稱取大鼠體重，應用水合氯醛對各組大鼠進行麻醉，麻醉狀態(tài)下通過穿刺大鼠腹主動脈取血，所取全血置于室溫下1h,之后以2000r/min 離心10min，分離血清，采用酶聯(lián)接免疫吸附法檢測并比較其各種性激素的血清學水平。取血結束后處死大鼠，將卵巢、子宮分別取出,剝離周圍黏連組織,在電子天平上分別稱取濕重,按下列公式計算卵巢指數(shù)與子宮指數(shù)。

2.3.2 多巴胺(DA)2 受體mRNA 檢測 ⑴實驗各組大鼠快速斷頭取腦，根據(jù)Paxinos 和 Watson 鼠腦立體定位圖譜與李耀宇成年大鼠紋狀體三維結構定位紋狀體[7,8]，于冰面上解剖出紋狀體，液氮速凍后快速放置于-80℃冰箱凍存; ⑵樣本檢測：按NCBI primer-blast 和 primer5.0 設計引物。引物序列 5′-GCTAGAGCCCCAGAGGAAGG-3′，使 用RNA 提取試劑盒提取紋狀體中總RNA，按產品說明書進行實驗操作，并測定RNA 濃度，總RNA 保存于-80℃溫度下，以防裂解。每樣本抽取2μg 的總RNA 進行反轉錄，實驗按產品說明書進行操作，反轉錄的 cDNA 置于-80℃溫度存放。應用SYBR Green PCR Mixtur 試劑盒，通過實時檢測擴增儀進行mRNA 的定量表達。在95℃溫度下預變性10min，之后置于59℃溫度下進行復性與延伸60s，95℃溫度下再次進行變性10s，共進行45 個循環(huán)操作。所有實驗重復操作3 次。

2.3.3 5-HT2 受體mRNA 檢測 各組大鼠斷頸后，實驗各組大鼠快速斷頭取腦,參照以上大鼠大腦立體定位圖，在冰面上解剖出下丘腦，并用生理鹽水洗去血污，液氮速凍后快速放置于-80℃冰箱凍存，測定5-HT2a 受體 mRNA 表達水平。運用RT-PCR檢測大鼠下丘腦5-HT2a 受體mRNA 表達水平。

2.3.4 卵巢smad4 mRNA 檢測 大鼠處死后取卵巢，生理鹽水沖洗血污,液氮速凍后置于-80℃冰箱保存，Samd4 引物設計，5′-AGAGCCAACACTGTG AGGA-3′,參照說明書，運用 RT-PCR 檢測大鼠卵巢smad4 mRNA 表達水平。

2.4 統(tǒng)計學方法 本實驗所得數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計軟件SPSS21.0 進行分析，實驗結果由均數(shù)±標準差（±s）表示，每組間用單因素方差分析，P<0.05 表示有顯著性差異。

3 結果

3.1 各組大鼠卵巢、子宮指數(shù)比較 由表1 可見，模型對照組大鼠的子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)比正常對照組明顯降低(P＜0.05)，補腎調經(jīng)組、雌激素組較模型對照組子宮指數(shù)、卵巢指數(shù)均有增高趨勢，其中補腎調經(jīng)組與模型對照組比較有顯著差異 (P＜0.05)，與雌激素組比較也存在差異(P＜0.05)，具有統(tǒng)計學意義。

表1 各組大鼠體重、卵巢、子宮指數(shù)（±s）

表1 各組大鼠體重、卵巢、子宮指數(shù)（±s）

注： △與正常對照組比，▲與模型對照組比，＃ 與雌激素組比，* 與補腎調經(jīng)組，P＜0.05

組別 樣本量 體重（g）卵巢指數(shù)(mg/g.W)子宮指數(shù)(mg/g.W)正常對照組模型對照組補腎調經(jīng)組雌激素組15 15 15 15 245.5±6.154 238.3±4.359 245.4±7.688 224.9±7.978 0.655±0.056▲0.381±0.036△＃*0.685±0.059▲＃0.427±0.045▲△*4.382±0.146▲2.898±0.272△＃*4.895±0.587▲＃3.012±0.534▲△*

3.2 各組大鼠血清性激素水平的變化 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清FSH、LH、GnRH水平明顯升高，血清E2 水平明顯降低（P<0.05）；與模型對照組比較，正常對照組、補腎調經(jīng)組及雌激素組大鼠血清FSH、LH 明顯降低，大鼠血清E2 水平明顯升高 （P<0.05）； 補腎調經(jīng)組與雌激素組比較，補腎調經(jīng)組血清FSH、LH 水平低于雌激素組，E2 水平高于雌激素組，雖未達到統(tǒng)計學意義（P>0.05），但提示補腎調經(jīng)方治療效果可能優(yōu)于雌激素，正常對照組與補腎調經(jīng)組GnRH 水平明顯低于模型對照組，具有統(tǒng)計學差異（P<0.05）；補腎調經(jīng)組PRL 低于其他各組，且具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），各組大鼠血清P、T 差異無統(tǒng)計學意義 （P>0.05）。見表2、表3。

3.3 各組大鼠多巴胺 D2 受體、5-HT2a 受體mRNA 表達水平 對各組大鼠5-HT2a 受體mRNA的影響，模型對照組大鼠5-HT2a 受體mRNA 含量均比其他各組升高，且具有統(tǒng)計學意義( P<0.05)，且補腎調經(jīng)組低于雌激素組，達到統(tǒng)計學意義( P<0.05)； 各組大鼠多巴胺D2 受體mRNA 水平比較，正常對照組大鼠多巴胺D2 受體mRNA 水平均高于其他各組，且具有統(tǒng)計學意義( P<0.05)，與模型組比較，補腎調經(jīng)組和雌激素組大鼠多巴胺D2 受體mRNA 水平均升高(P<0.05)；說明雌激素及補腎調經(jīng)方可增強大鼠多巴胺D2 受體mRNA 表達，下調 5-HT2a 受體 mRNA 表達。見表4。

表2 各組大鼠血清 E2、FSH、LH 含量的比較（±s）

表2 各組大鼠血清 E2、FSH、LH 含量的比較（±s）

注： △與正常對照組比，▲與模型對照組比，＃ 與雌激素組比，* 與補腎調經(jīng)組P＜0.05

組別 樣本量FSH（IU/L） LH（IU/L） E2（ng/L） GnRH（pg/ml）正常對照組模型對照組補腎調經(jīng)組雌激素組15 15 15 15 16.592±1.968▲34.359±2.893△＃*20.281±3.076▲22.219±2.336▲19.687±2.228▲40.561±4.728△＃*23.463±4.425▲21.475±7.889▲94.479±9.891▲56.025±2.673△＃*93.265±4.987▲89.786±5.485▲19.562±2.116▲33.562±3.349△＃*22.889±3.506▲28.658±3.889△

3.4 各組大鼠卵巢smad4 mRNA 表達水平 與模型組比較，補腎調經(jīng)組和雌激素組大鼠卵巢smad4 mRNA 水平均升高(P<0.05)；說明各治療組可增強大鼠卵巢smad4mRNA 表達，模型組與正常對照組比較，雷公藤多苷灌胃的模型組卵巢smad4 mRNA表達水平低于正常對照組，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表5。

表3 各組大鼠血清 P、T、PRL 含量的比較（±s）

表3 各組大鼠血清 P、T、PRL 含量的比較（±s）

注： △與正常對照組比，▲與模型對照組比，＃ 與雌激素組比，* 與補腎調經(jīng)組P＜0.05

組別 樣本量 P（ng/ml） T（ng/ml） PRL（uIU/ml）正常對照組模型對照組補腎調經(jīng)組雌激素組15 15 15 15 32.189±5.988 30.893±8.006 32.336±9.298 32.008±3.125 17.238±4.701 18.028±4.306 17.098±4.526 18.123±5.406 130.948±4.136*128.387±9.884*122.368±12.885△▲＃129.146±9.662*

表4 各組大鼠多巴胺D2 受體、5-HT2a 受體mRNA 表達水平比較（±s）

表4 各組大鼠多巴胺D2 受體、5-HT2a 受體mRNA 表達水平比較（±s）

注： △與正常對照組比，▲與模型對照組比，＃ 與雌激素組比，※與補腎調經(jīng)組P＜0.05

組別 樣本量 5-HT2a 受體mRNA 多巴胺D2 受體mRNA正常對照組模型對照組補腎調經(jīng)組雌激素組15 15 15 15 0.130±0.078▲0.150±0.051△※＃0.104±0.152▲0.125±0.072▲1.936±0.053▲＃※1.243±0.118△＃※1.391±0.261△▲1.382±0.083△▲

表5 各組大鼠卵巢Smad4 mRNA 表達比較（±s）

表5 各組大鼠卵巢Smad4 mRNA 表達比較（±s）

注： △與正常對照組比，▲與模型對照組比，＃ 與雌激素組比，※與補腎調經(jīng)組P＜0.05

組別 樣本量 Smad4 mRNA正常對照組模型對照組補腎調經(jīng)組雌激素組15 15 15 15 0.581±0.089▲0.350±0.058△※＃0.608±0.065▲0.515±0.052▲

4 討論

月經(jīng)是子宮周期性出血為表現(xiàn)的一種生理現(xiàn)象。中醫(yī)發(fā)展源遠流長，縱觀史料，在中醫(yī)學中，并無“月經(jīng)失調”這一病名的歷史記載。臨床上常歸于 “血枯經(jīng)閉”、“月經(jīng)先后不定期”、“月經(jīng)過少”、“月經(jīng)后期”、“血隔” 等范疇。在月經(jīng)的產生過程中，中醫(yī)方面認為腎為主導，腎氣與天癸[9-11]共同主宰，沖、任二脈與胞絡相互關聯(lián)，相資為用，只有腎-天癸-沖任-胞宮功能維持平衡狀態(tài)下，月經(jīng)才能月月來潮，如期而至。現(xiàn)代醫(yī)學認為月經(jīng)主要通過下丘腦-垂體-卵巢軸調節(jié)[12]。下丘腦內含有神經(jīng)細胞及腺垂體促性腺激素細胞等，GnRH（Gonadotropin releasing hormone）由神經(jīng)細胞分泌，是下丘腦-垂體-卵巢軸的啟動激素； 卵泡刺激素FSH （Follicle-stimulating hormone） 與黃體生成素LH（Luteinizing hormone）由腺垂體促性腺激素細胞分泌，雌二醇由卵泡刺激素FSH 刺激卵泡分泌，卵泡刺激素還能促進卵泡生長發(fā)育及調節(jié)優(yōu)勢卵泡的選擇作用；雄激素由黃體生成素LH 刺激卵泡細胞合成，黃體生成素還能為雌二醇合成提供底物、促使排卵及維持黃體功能； 雌激素和孕激素由卵巢分泌，雌激素能夠促進子宮內膜腺體增生，促進卵泡發(fā)育,孕激素能使子宮內膜由增生期轉化為分泌期。子宮內膜由內至外分為致密層、海綿層、基底層，致密層及海綿層為功能層，主要參與月經(jīng)形成,子宮內膜增殖期處于月經(jīng)周期的第5-14 d，下丘腦神經(jīng)細胞分泌GnRH，刺激腺垂體，使腺垂體FSH 分泌增加，F(xiàn)SH 作用于卵巢，促使雌激素分泌增加，子宮內膜在雌激素等激素的作用下逐漸增厚，第 23-28 d 黃體萎縮，雌激素、孕激素明顯下降，子宮內膜失去雌激素及孕激素作用，海綿層從基底層脫落,形成內膜碎片與血液一起從陰道排出，即為月經(jīng)。雌孕激素在維持女性第二性征及生殖方面起到重要作用[13]。現(xiàn)代醫(yī)學研究結果發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷通過影響卵巢血管生成及血液供應，雷公藤多苷片灌胃小鼠模型發(fā)現(xiàn)卵巢血管面積明顯減少，血管壁厚度增大，血液供應減少，表明雷公藤多苷片可影響卵巢功能； 同時發(fā)現(xiàn)雷公藤多苷可導致各級卵泡數(shù)量減少，發(fā)現(xiàn)黃體內脂質空泡增多，且血清發(fā)現(xiàn) P 水平較低，E2 較低，F(xiàn)SH、LH血清升高說明雷公藤多苷片對黃體有抑制作用。

本研究結果顯示，在性激素水平方面，中藥補腎調經(jīng)方對雷公藤多苷所致卵巢早衰大鼠血清性激素水平具有較顯著的調節(jié)作用，可降低FSH、LH、GnRH 水平，提高 E2 血清水平，促進卵巢功能的恢復； 目前現(xiàn)代醫(yī)學使用雌激素替代治療雖可有效改善患者性激素水平，但并發(fā)癥、副作用多，且停藥后易反復，效果不穩(wěn)定，補腎調經(jīng)方治治療效果達到甚至超過雌激素替代組，能夠較好地鞏固生殖內分泌功能，停藥后不易反復，提高臨床治療率及患者依從性。

目前研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體主要有5 種，多巴胺D1-D5 受體，分為兩大類，多巴胺D1 類受體和D2 類受體[14]，多巴胺 D1 類受體包括 D1R 和 D5R；多巴胺 D2 類受體，包括 D2R、D3R、D4R。多巴胺D1 類受體能激活腺苷酸環(huán)化酶第二信使系統(tǒng)，使cAMP 含量升高，且只作用于突觸后DA 接受性細胞，如紋狀體r-氨基丁酸GABA 中型多棘神經(jīng)元。多巴胺類D2 受體與多巴胺類D1 類受體不同，D2R、D3R 不僅表達于多巴胺細胞的突觸后，也表達于多巴胺能神經(jīng)元的突觸前。多巴胺D2 類受體具有更加復雜的功能與作用。多巴胺受體既參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的活動也參與調節(jié)外周各種活動，如腎功能的調節(jié)、血壓的調節(jié)、血管舒張、胃腸的蠕動、嗅覺、視覺、性活動、母性行為及各類激素調節(jié)。5-HT 位于人體大多數(shù)組織、器官中，主要位于神經(jīng)元、松果體及血小板中。5-HT 通過激動不同的5-HT 受體類型，起到不同藥理作用，如5-HT1、5-HT2、5-HT6 和 5-HT7 受體與睡眠-覺醒相關[15]，5-HT1a、5-HT2a 受體與抗失眠研究相關。5-HT 是控制情緒的主要物質，直接影響著人的生理和心理功能，是機體重要的神經(jīng)遞質之一，目前公認中樞缺乏5-HT 可能引起抑郁。5-HT 通過5-HT 受體發(fā)揮作用，其中5-HT2A 受體興奮時可抑制厭惡反應及精神分裂[16]，而5-HT1A 受體興奮可有抗焦慮及抗抑郁作用[17]。Osterlund 等[18]證實抑郁癥大鼠腦中在與情感、認知和記憶功能有關的腦區(qū)5-HT 受體1 高度表達，而5-HT 受體2 表達降低。本實驗發(fā)現(xiàn)補腎調經(jīng)方與雌激素均能使大鼠多巴胺D2 受體mRNA 表達水平均升高及使5-HT2a 受體mRNA 表達水平下降，且具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；表明補腎調經(jīng)方通可能通過增強大鼠多巴胺D2 受體mRNA 表達及下調5-HT2a 受體mRNA 表達達到治療雷公藤多苷所致月經(jīng)失調。

Smads 蛋白家族目前至少由9 位成員組成，是重要的信號轉導蛋白，與TGF-B 信號轉導系統(tǒng)共同參與細胞內信號轉導,起到效應因子作用,Smads 4 為一種抑癌基因,目前研究發(fā)現(xiàn)其在血管瘤與腦缺血等多種血管疾病、胰腺癌與子宮內膜癌等腫瘤疾病發(fā)病中起重要作用[19-22]。本實驗證實補腎調經(jīng)方可上調卵巢與子宮smad4mRNA 表達，通過上調卵巢smad 基因的表達改善雷公藤多苷所致月經(jīng)失調。總之，smad4 mRNA 表達的下降可能是雷公藤多苷導致雌性生殖損傷的關鍵點之一。

綜上所述，補腎調經(jīng)方治療雷公藤多苷所致月經(jīng)失調的臨床效果顯著，能夠顯著改善癥狀，通過調節(jié)下丘腦-垂體-卵巢軸中性激素水平、受體與基因表達水平治療雷公藤多苷片所致月經(jīng)失調，能夠顯著提高丘腦中多巴胺D2 受體mRNA 及卵巢與子宮內膜smad4 mRNA 表達水平，降低5-HT2a 受體mRNA 表達水平，升高血清E2 水平，降低FSH、LH、GnRH 水平,雷公藤多苷在治療風濕性疾病中較常使用,在治療過程中可能影響卵巢血供引起女性卵巢早衰,在大鼠模型中使用補腎調經(jīng)方能夠改善模型鼠的卵巢血供使得模型鼠的性激素水平與正常對照組相似,為臨床治療雷公藤多苷導致的女性卵巢早衰提供了一定的理論依據(jù)。