不同放牧對滇西北高原泥炭沼澤土壤氨氧化微生物群落的影響

陳 梨,鄭榮波,郭雪蓮,*,侯亞文

1 西南林業大學國家高原濕地研究中心,昆明 650224

放牧過程伴隨著植物的啃食,牲畜踐踏及排泄物的輸入[18],使土壤的環境因子發生改變[6,19],勢必影響AOA和AOB群落結構和多樣性,進而影響土壤氮循環過程。大量研究表明,放牧影響土壤微生物多樣性和群落組成[6, 20- 22],Olivera等[23]的研究發現不同放牧強度對不同植被覆蓋的區域土壤細菌多樣性的影響不同。Suleima等[24]的研究發現豬糞肥(多種動物的排泄物和水混合)的施用降低土壤AOB的多樣性,改變其群落結構,Orwin等[25]研究發現在草原生態系統中,牛尿液的施用改變土壤AOB的群落結構。但目前關于不同放牧類型對泥炭沼澤土壤氨氧化微生物群落組成及其多樣性的影響鮮見報道。

滇西北是云南高原濕地的集中分布區,地處少數民族聚集的農牧交錯帶,放牧是當地濕地資源利用的主要途徑。滇西北高原納帕海濕地是受放牧干擾最嚴重最典型的區域,主要的放牧類型是牦牛放牧和藏香豬放養。牦牛放牧主要是踐踏土壤、取食植物地上部分,藏香豬放養主要是對原位土壤進行劇烈翻拱擾動,破壞地表植物,使表層土壤裸露,破壞地下草根層造成土壤結構發生改變[26]。目前,納帕海藏豬的載畜量達到115頭/km2,已遠超過當地的承載率是40頭/km2,藏香豬放養破壞納帕海濕地面積約總面積的5%[27]。放牧干擾會影響濕地土壤理化性質和PNR,影響土壤AOA和AOB群落,進而導致高原濕地氮循環的過程發生改變。因此,研究放牧活動對AOA和AOB群落結構及其多樣性的影響對于預測放牧對濕地氮循環的影響至關重要。本研究選取滇西北高原泥炭沼澤濕地圍欄禁牧區和長期放牧區為研究區,研究放牧干擾(牦牛放牧和藏香豬放養)對泥炭沼澤土壤理化性質,PNR,AOA和AOB群落結構及其多樣性的影響,并通過分析土壤理化性質、PNR和AOA和AOB群落結構及其多樣性之間的關系,闡明放牧對泥炭沼澤土壤氨氧化功能影響的內在機制,為濕地土壤微生物對放牧干擾的響應機制研究提供理論基礎,為滇西北高原濕地放牧管理提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 研究區的概況

研究區位于滇西北高原的納帕海國際重要濕地(99°35′—99°43′ E, 27°47′—27°55′ N)內的泥炭沼澤濕地。納帕海濕地屬于青藏高原與亞熱帶季風氣候區和中南半島熱帶季風區的結合部,行政上隸屬云南省迪慶藏族自治州香格里拉市,平均海拔3260m。納帕海發育于石灰巖母質的中甸高原上,受喀斯特作用的強烈影響,湖盆底部被蝕穿而形成落水洞,湖水在地下匯集后從北部穿過小背斜出露形成支流匯入金沙江。湖盆四周山嶺環繞,從湖盆中心至湖岸生長著大量的水生和陸生植被,湖濱有較大面積的沼澤和沼澤化草甸,周圍山上生長硬葉常綠闊葉林和云杉(Picealikiangensis)冷杉(Abiesgeorgei)針葉林以及灌叢。具有高寒、年均溫低、霜期長、氣溫年較差和日較差大、干濕季節分明等特點。年均溫為5.4℃,年降水量為619.9mm,主要集中在6—8月[28]。土壤類型以草甸土、沼澤化草甸土、沼澤土和泥炭土為主。

1.2 實驗樣地設計

實驗地選擇在納帕海國際重要濕地哈木谷村神湖附近的泥炭沼澤地(圖1)。該區域土壤類型為典型泥炭沼澤土,地表無積水,土壤飽和,植被主要有水蔥(Schoenoplectustabernaemontani)、苔草(Carex)、杉葉藻(Hippurisvulgaris)、矮地榆(Sanguisorbafiliformis)等。本研究選取土壤類型、水文和地貌特征相對一致的區域設置樣地。選擇地表植被未受啃食,土壤未受到干擾,禁止放牧的區域設置為對照區(CK)。在受牦牛放牧干擾,地表植被被啃食,土壤被牦牛踐踏壓實,且地上部分植物群落結構遭受到嚴重破壞的區域設置牦牛放牧區(YT)；在地表植物和土壤草根層受到藏香豬翻拱擾動破壞,表層土壤裸露,具有典型豬拱斑塊的區域藏香豬放養區(PA)。在對照區、牦牛放牧區和藏香豬放養區分別設置10m×10m的樣地,沿樣地的對角線分別選取3個1m×1m的小樣方。每個小樣方以“s”形采樣,用直徑5cm的土壤鉆取土柱0—10cm的土壤,每5個小樣方混合為一個樣品,每個處理有3個重復樣品。剔除土壤中可見的石塊和動植物殘體后,土樣用無菌自封袋保存于液氮中,帶回實驗室過2mm篩后一部分保存于80℃超低溫冰箱,用于分子生物學分析；另一部分土樣自然風干,用于測定土壤基本化學性質。

圖1 實驗樣地Fig.1 Experimental plots

1.3 土壤基本理化性質和潛在硝化勢的測定

1.4 土壤DNA提取

土壤樣品的總DNA 提取采用Power Soil DNA Isolation Kit 試劑盒(MOBIO公司,美國)試劑盒,用0.5g 新鮮土壤完成基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA。進一步進行AOA 和AOB 的PCR 擴增。

1.5 氨氧化微生物的測定

AOA 的擴增引物設計為Arch-amoA-F (5′-STAATGGTCTGGCTTAGACG- 3′)/Arch-amoA-R (5′-GCGGCCATCCATCTGTATGT- 3′)[30]和AOB的擴增引物為amoA- 1F (5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT- 3′)/amoA- 2R (5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC- 3′)[31]。所有PCR反應均采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase,20μL反應體系：4μL5*FastPfu 緩沖液,2μL 2.5mmol/L dNTPs,0.8μL引物(5μmol/L),0.4μLFastPfu聚合酶；10ng DNA模板以及約10ng DNA模板,其余的用滅菌水補足。AOB和AOA-amoA基因PCR 反應條件如下：95℃變性5min,然后27個循環(95℃變性30s,在55℃30s,在72℃延伸1min)。最后72℃延伸10s。全部樣本按照正式實驗條件進行,每個樣本3個重復,將同一樣本的PCR產物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳回收產物,采用AxyPrepDNA 凝膠回收試劑盒(AXYGEN公司)進行純化。并使用用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(Promega公司)進行檢測定量,之后按照每個樣本的測序量要求,進行相應比例的混合。純化的PCR產物使用NEBNext?UltraTMDNA文庫制備試劑盒(Illumina,NEB,USA)生成測序文庫,最后在Illumina MiSeq平臺上進行高通量測序(凌恩,中國上海)。

原始測序序列使用 Trimmomatic 軟件質控,使用 FLASH 軟件進行拼接：使用UPARSE軟件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/),根據97%的相似度對序列進行操作分類單元(Operational Taxonomic Units,OTU)聚類,并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體。利用RDPclassifier(http://rdp.cme.msu.edu/) 對每條序列進行物種分類注釋,比對Silva 數據庫(SSU123),設置比對閾值為70%。應用軟件Mothur(version v.1.30.1),計算Chao1和ACE指數,用來估計微生物豐富度,并使用Shannon和Simpson指數來估計微生物多樣性。所有這些指數均使用QIIME計算。使用Weighted unifrac主坐標分析(PCoA)以分析微生物群落β多樣性的差異(R.3.3.2)。

1.6 統計分析

使用SPSS 軟件進行統計分析,以P<0.05為統計差異。用單因素方差分析(ANOVA)方法,檢驗處理之間土壤理化性質和氨氧化微生物功能基因多樣性的差異顯著性。Spearman等級相關分析用來評估土壤理化性質,PNR與土壤功能微生物的α多樣性(Chao1、ACE、Shannon和Simpson)的相關性。采用R.3.3.2軟件對 AOA和AOB amoA基因序列OTU 進行維恩(Venn) 分析。利用Canoco(4.5)多元統計模型分析樣本空間差異特征,利用蒙特卡羅置換檢驗分析環境因子對氨氧化微生物群落影響顯著水平,用典型對應分析(Canonical correspondence analysis, CCA),找出對環境變化的敏感微生物。

2 結果與分析

2.1 不同放牧對土壤理化性質和硝化潛勢的影響

表1 不同放牧對泥炭沼澤土壤理化性質的影響

列內不同的小寫字母表示顯著性水平P<0.05；表中數據為平均值±標準差(n=3); CK：對照樣地Control；YT：牦牛放牧區Yak-grazing; PA: 藏香豬放養區Pig -grazing;TN: Total nigrogen; TP: Total phosphorous;TOC: Total organic carbon

圖2 不同放牧對沼澤濕地土壤硝化潛勢的影響 Fig.2 The influence of different grazing on soil potential nitrification rates of peatland CK：對照樣地Control；YT：牦牛放牧區Yak-grazing；PA: 藏香豬放養區Pig-grazing

2.2 不同放牧對土壤氨氧化微生物多樣性的影響

2.2.1α多樣性

總體上,平均每一個樣本的AOA和AOB 的測序深度分別為34306、39180條序列。AOA及AOB的稀釋曲線都趨向于平坦的狀態,說明測序是合理的(圖3)。

對照區、牦牛放牧區和藏香豬放養區的土壤均基于97%的相似度下,每個樣本的AOA和AOB文庫覆蓋度都達到99%(表2)。AOA的OTU數目、Chao1和ACE指數均表現為CK>YT> PA,PA與CK和YT差異均顯著,而CK和YT差異不顯著。AOA的Shannon指數表現為YT>CK>PA,而AOA的Simpson指數表現為PA> YT>CK(P>0.05)。AOB的OTU數目、Chao1和ACE指數均表現為CK> PA>YT(P<0.05),AOB的Shannon指數表現為CK> PA>YT,AOB的Simpson指數表現為YT高于 PA和CK(P>0.05)。表明牦牛放牧和藏香豬放養降低土壤AOA和AOB 的豐富度,藏香豬放養對AOA豐富度的影響更顯著,牦牛放牧對AOB豐富度的影響更顯著。牦牛放牧降低了AOB的多樣性。藏香豬放養降低了AOA和AOB的多樣性。

圖3 基于OTU 數目97%相似度的AOA和AOB 的稀釋曲線Fig.3 Rarefaction curve of the OTU number at 97% similarity for AOA (a) and AOBOTU：操作分類單元,Operational Taxonomic Units；AOA： 氨氧化古菌,ammonia-oxidizing archaea；AOB： 氨氧化細, ammonia-oxidizing bacteria

表2 不同放牧對沼澤濕地土壤AOA和AOB的amoA基因多樣性指數的影響

Table 2 The α-diversity indices of AOAamoAandAOBamoAof peat swamp soil with influence of different grazing

微生物Microbial樣地Plots覆蓋度CovergeOTU 數目OTU numbersChao1指數 ACE指數Shannon 指數 Simpson 指數Chao1 indexACE indexShannon indexSimpson indexAOACK0.99102.00±40.47a110.00±46.01a107.00±43.18a2.13±2.19a0.17±0.03aYT0.9984.00±3.56a84.00±4.32a84.00±3.56a2.34±2.12a0.28±0.07aPA0.9928.00±9.63b27.33±10.5b28.00±9.63b1.69±1.13b0.49±0.23aAOBCK0.99158.00±7.26a165.33±8.38a163.67±6.85a3.27±3.31a0.08±0aYT0.9985.67±4.64c95.33±8.58c92.00±5.35c2.70±2.68b0.35±0.33aPA0.99119.00±12.36b126.00±14.51b124.33±12.5b3.15±3.06a0.08±0.01a

同一列內不同的小寫字母表示顯著性水平P<0.05；表中數據為平均值±標準差(n=3); AOA：氨氧化古菌,ammonia-oxidizing archaea； AOB：氨氧化細菌,ammonia-oxidizing bacteria；OTU：操作分類單元, Operational Taxonomic Units；ACE：基于蓋度的估計量,abundance-based coverage estimator

2.2.2β多樣性指數

基于weighted unifrac PCoA的分析,AOA的PC1和PC2分別為53.01%和32.19%(圖4)。CK和YT組間的樣本在PC1的方向上區分開,而CK與PA土壤組間的樣本在PC1和PC2方向上都區分開。排序結果較好的反映了土壤微生物群落在對照區、牦牛放牧區和藏香豬放養區的整體狀況,且區分度高,表明牦牛放牧和藏香豬放養均對土壤的AOA的β多樣性的影響比較顯著。AOB的PC1和PC2分別為62.40%和19.82%。CK在PC1的方向與YT組間的樣本區分開,但與PA沒有區分開(圖4)。表明牦牛放牧對土壤的AOB的β多樣性的影響比較顯著,而藏香豬放養對AOB的β多樣性的影響相對比較小。

圖4 不同放牧對泥炭沼澤土壤AOA及AOB 的β多樣性分析Fig.4 The β diversities of AOA and AOBof peat swamp soil with influence of different grazing

2.3 不同放牧對土壤氨氧化微生物群落結構的影響

在AOA-amoA基因的門分類水平上,泉古菌門(Crenarchaeota)在對照區土壤中相對比重最高,約占62.8%,在牦牛放牧區和藏香豬放養區土壤中分別占6.5%和2.7% (圖5)。在AOA-amoA基因的屬分類水平上,對照區土壤中泉古菌門(Crenarchaeota_norank)的屬占62.8%,但在牦牛放牧和藏香豬放養區土壤中分別為6.5%和2.7%。在AOB-amoA基因的門分類水平上,變形菌門(Proteobacteria)在對照區土壤中約占99.9%,在牦牛放牧區和藏香豬放養區土壤中分別占97.6%和99.0%。在AOB-amoA基因的屬分類水平上,亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)在對照區土壤中約占99.9%,在牦牛放牧區土壤中和藏香豬放養區占96.1%和98.0%。可見,牦牛放牧和藏香豬放養均對土壤AOA群落組成影響比較顯著,對土壤AOB群落組成的影響比較小。

圖5 不同放牧對沼澤濕地土壤AOA門(a),AOB門(b),AOA屬(c)及AOB屬(d)的相對豐度Fig.5 Relative abundance of AOA phyla (a), AOB phyla (b), AOA genera (c) and AOB genera (d) of peat swamp soil with influence of different grazing

不同放牧處理中AOA-amoA和AOB-amoA基因序列OTU的Venn分析(圖6)。不同放牧影響下AOA-amoA基因共獲得259個AOA-amoA基因序列OTU,不同放牧共有OTU數目為10個,占總OTU數目的3.8%。特有的OTU數目表現為CK>YT>PA,不同放牧影響下AOB-amoA基因序列OTU共獲得287個,不同放牧共有OTU為82個,占總OTU的28.5%。其中,特有的OTU表現為CK>YT>PA。總體上,不同放牧對AOA-amoA基因的OTU數量和分布影響比AOB-amoA基因更顯著,藏豬放養比牦牛放牧區的特有的OTU數目更少。

圖6 不同放牧AOA和AOB amoA 基因序列OTU 的Venn圖Fig.6 Venn diagram of AOA and AOB amoA genes based on OTU in different grazing

2.4 土壤理化性質、PNR 與氨氧化微生物群落的關系

表3 土壤理化性質,PNR及AOA與AOB 多樣性的關系

*相關系數的顯著水平P<0.05 **相關系數顯著性P<0.01. ACE：基于蓋度的估計量,abundance-based coverage estimator

圖7 土壤AOA-amoA和AOB-amoA基因群落組成和環境因子的典型對應分析Fig.7 Canonical correspondence analysis of relationship between the environmental factors and community structures of AOA-amoA gene and AOB-amoA gene Archace_norank：屬于古菌門；Crenarchaeota_norank：屬于泉古菌門；unclassfied: 未分類的菌；Thaumarchaeota_norank:屬于奇古菌門；sphingobium：鞘脂菌屬；Nitrosospira：亞硝化螺菌屬；Nitrosomonas：亞硝化單細胞菌；Nitrosovibrio:弧菌屬; pH: 土壤pH; TN：總氮Total nitrogen content；TP：總磷Total phosphorus；TOC：總有機碳Total organic 銨態氮Ammonium 硝態氮Nitrate content；PNR：硝化潛勢Potential nitrification rate

3 討論

3.1 放牧對土壤理化性質和PNR的影響

3.2 放牧對土壤氨氧化微生物多樣性的影響

放牧對微生物多樣性的影響依賴于環境條件、土壤特性、植凋落物質量和數量、放牧強度和動物類型的綜合作用[39]。藏香豬放養和牦牛放牧均降低土壤AOA的多樣性,但牦牛放牧對AOA的多樣性的影響不顯著。研究表明,在放牧最嚴重的地區,AOA的多樣性最低[40]；適量的尿素可增加AOA的多樣性,而長期施加尿素降低AOA的多樣性[41],動物尿液中含有90%的尿素[42]。牦牛放牧和藏香豬放養過程中由于干擾強度和排泄物的輸入不同會對土壤AOA多樣性產生不同的影響。牦牛放牧顯著降低土壤AOB的多樣性(P<0.05),但藏香豬放養對土壤AOB的多樣性的影響不顯著。這與研究發現在放牧強度最嚴重地區,AOB的多樣性最高不一致[40],原因是在本研究中受放牧影響的土壤pH,TOC和總氮含量沒有出現向高水平轉化,而是比未受干擾的對照區的土壤更低。也有研究表明,放牧降低了土壤微生物的多樣性[33]。牦牛放牧和藏香豬放養均降低土壤AOA和AOB的豐富度,藏香豬放養和牦牛放牧分別對AOA和AOB豐富度的影響更顯著。這主要是不同的放牧方式對土壤養分的影響不同,微生物多樣性的變化還會受到其他綜合環境因素的影響。

AOA與AOB的群落組成隨環境因素變化而發生改變[43]。牦牛放牧和藏香豬放養活動改變了氨氧化微生物的群落組成,原因是這兩種放牧活動導致土壤環境因子發生了改變。

3.3 放牧對氨氧化微生物群落結構的影響

4 結論

(2)牦牛放牧降低土壤AOA的豐富度和AOB的α多樣性,改變土壤AOA和AOB的β多樣性；藏香豬放養降低土壤AOB的豐富度和AOA的α多樣性,二者均降低Crenarchaeota的相對豐度。藏香豬放養對土壤α多樣性和群落結構的影響比牦牛放牧更顯著。