LiCl/DMSO溶劑體系對分離球磨稻草木質素的影響

吳文娟 王博偉 何 賢 閆雪晴 鄒春陽

(南京林業大學 江蘇省林業資源高效加工利用協同創新中心，南京 210037)

木質素是可再生資源中唯一能大量提供可再生芳香基的化合物，可用于生產生物質燃料、輕質芳烴及其他芳香性小分子化合物等，應用潛力巨大[1]。

木質纖維原料主要由纖維素、半纖維素和木質素相互交織組成的致密、不易降解的復合體系，其中化學組分之間存在的化學或物理上的鏈接決定了任何一種化學組分的完全分離必然受到其他組分的阻擾。到目前為止，還沒有找到一種理想可行的分離方法，可以將木質素這單一組分從原料中無破壞地分離出來。磨木木質素(MWL)和纖維素酶解木質素(CEL)是目前比較經典的分離方法，CEL是在MWL分離的基礎上增加纖維素酶水解處理以降解高聚糖，但木質素分離的得率還是不高。自Swatloski等[2]首次提出可溶木粉的離子液體以來，尋找能溶解木質纖維原料溶劑體系用于木質素分離就一直受到研究者們的關注。Fasching等[3]以球磨木粉為原料，采用二甲基亞砜/甲基咪唑溶劑，將球磨原料完全溶解于該溶劑體系，通過液-液提取的方式來分離木質素，得到的木質素與經典方法分離出來的磨木木質素類似。研究發現溶解再生處理可以提高木質纖維原料的酶解效率[4-5]，木質纖維原料經溶劑體系溶解再生后，纖維素結晶區會遭到破壞，與未經處理的原料相比，再生、酶水解處理會導致更多的高聚糖降解[6-8]，該處理方法可以嘗試用于木質素的分離。Zhang等[9]用二甲亞砜/N-甲基咪唑溶劑對球磨8 h椴木和球磨10 h濕地松進行預潤脹、經再生后進行纖維素酶解、提取CEL，木質素得率分別提高9%和5%，結果表明通過溶劑溶脹再生得到的CEL與傳統的CEL相比無明顯的結構差異。氯化鋰/二甲基亞砜(LiCl/DMSO)溶劑體系，一直都用作高聚物的反應溶劑介質[10]，也常用作溶解纖維素和半纖維素的溶劑，DMSO通過破壞分子間和分子內的氫鍵使微纖絲發生潤脹，LiCl通過與纖維素分子中羥基上氫結合，形成氫鍵，并破壞纖維素晶格中的原有氫鍵網絡，還可阻止氫鍵的重建[11-12]，導致結晶區破壞，進一步促進纖維原料在該體系中的溶解。LiCl/DMSO 溶劑體系是本課題組基于針葉材和闊葉材開發的全溶體系溶劑，研究結果表明球磨2 h的木粉可完全溶解在該體系中，再生處理后，纖維素的結晶度下降，但木質素的含量、結構沒有受到影響[13]。這樣的體系也能溶解球磨稻麥草等非木材原料，也得到了同樣的再生結果[14-17]。

通過溶劑的溶解再生探討稻草中化學成分溶出規律方面的研究尚未見報道。本研究用LiCl/DMSO 溶劑體系對球磨稻草進行溶解再生，結合纖維素酶水解來研究原木質素分離的可行性，旨在通過溶解再生木質纖維原料，得到木質素的溶出行為規律，并用于分離原料中原木質素，以期為獲得高純度和高得率的非木材分離木質素提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用稻草取自江蘇省高郵市，原料經風干后，選取稻草的稈和葉部位，剪成約40 mm的段、在Wiley微型粉碎機中粉碎，取40～80目組分，用苯醇(2∶1，v/v)抽提8 h，經風干、真空干燥后，貯存于廣口瓶中，供分析使用。

經脫脂后草片原料的化學成分見表1，脫脂原料的處理過程見圖1。

表1 脫脂稻草主要化學成分Table 1 Chemical compositions of extractive free rice straw

圖1 脫脂稻草原料的工藝流程
Fig.1 Technological procedure of the treatment of extractive free rice straw raw material

1.2 球磨

稻草的各部位球磨在德國Fritsch公司Pulverisette 7微型行星式高能球磨機中進行。在45 mL氧化鋯制的罐子里稱取4 g干燥后的脫脂草粉，內裝18只內徑1 cm的氧化鋯球，在600 r/min條件下進行0.5，1.0，2.0，4.0，6.0及8.0 h不同時間的球磨，每運行5 min，休停10 min，以避免設備過熱。球磨草粉經真空干燥后，裝瓶備用。

1.3 再生處理

取球磨0.5，1.0，2.0，4.0，6.0及8.0 h的原料各10 g，分別用90 mL 8%(w/w) LiCl/DMSO溶劑體系處理，室溫下磁力攪拌48 h 后，整個混合體系全部轉移入透析袋(孔徑50 ?、直徑28 mm、透過分子量為14 000)，將透析袋浸入去離子水中進行透析，每隔4 h換次水，每次用AgNO3溶液檢測透析液中有無Cl-，直至完全置換出LiCl/DMSO溶劑體系。透析后的物料經冷凍干燥、真空干燥后，裝瓶備用。

再生得率為再生后原料的質量占再生前球磨原料質量的百分含量。

1.4 酶水解

分別稱取絕干球磨0.5～8.0 h 的再生原料5 g于 250 mL錐形瓶中，加入酶活為 30 U/mL 的混合酶液，按每克絕干葡聚糖為基準，酶用量取 30 U/g，用pH 4.8 的醋酸―醋酸鈉緩沖液，調節酶水解底物質量分數為 5%，將250 mL錐形瓶置于SHA-C恒溫振蕩器中，在 50 ℃，180 r/min的條件下振蕩反應72 h。酶水解結束后混合體系在 5 000 r/min 下離心 15 min，分離出的殘渣依次用緩沖液和蒸餾水離心洗滌各3次，酶水解殘渣經冷凍干燥、真空干燥后，保存備用。

酶水解得率為酶水解后殘渣質量占酶水解前用于酶水解的再生原料質量的百分含量。

混合酶液(Novozymes提供)組成：CCN03110纖維素酶，酶活118 U/mL；CFN00244木聚糖酶，酶活1 196 U/mL；DCN00207β-纖維二糖酶，酶活480 U/mL。酶活按文獻[18]方法測定。

1.5 分析方法

1.5.1化學成分測定

木質素含量、灰分的含量按照文獻[19]方法測定酸不溶木質素(Klason木質素)含量和灰分含量。以 4%H2SO4為參比，水解液用日本Shimadzu公司的紫外-可見分光光度計(UV-240)測定在波長 205 nm處的吸光度，計算酸溶木質素的含量。木質素總量=酸不溶木質素含量+酸溶木質素含量。

高聚糖含量的測定參照文獻[20]。用日本Shimadzu公司的氣相色譜儀(GC-14b)分析高聚糖。氣相色譜條件如下：毛細管柱TC-17(0.25 mm×30 m)；FID檢測器；柱溫程序，220 ℃保留20 min，進樣溫度，220 ℃，檢測溫度，230 ℃；GC分析得到的單糖均轉換為高聚糖。同時進行2次測定，取其平均值。

1.5.2硝基苯氧化

硝基苯氧化操作可參照文獻[21]。同時進行2次測定，取其平均值。

1.5.3可萃取木質素測定

按照文獻[22]測定可萃取木質素的含量。同時測定2次，取其平均值。萃取得率為可萃取木質素質量占樣品中木質素質量的百分含量。

式中：A，280 nm的吸光度；D，稀釋倍數；V，萃取的濾液體積，mL；W，樣品木質素絕干重，g；13，吸光系數。

2 結果與討論

2.1 球磨草粉經LiCl/DMSO體系處理后再生得率

由表2可知，木質纖維原料在生物構造和化學組成上的差異性決定了LiCl/DMSO溶劑體系處理不同木質纖維原料的效果會不一樣。作為非木材原料，稻草容積比重大、質地較疏松，化學組成中木質素含量遠小于木材中木質素含量，但是稻草灰分含量較高，再生能力普遍低于木材。另外，稻草在化學構造上是不均一的，葉、稈、穗和鞘等不同部位的化學成分分布也不均勻。隨著球磨作用程度的增加，球磨稻草葉中的化學組分在LiCl/DMSO體系處理過程中更易于溶出，與稻草中稈相比，其再生后的得率較低。

表2 不同球磨時間LiCl/DMSO處理的稻草部位再生得率Table 2 Yield of regenerated straw samples with different milling time from LiCl/DMSO %

2.2 球磨草粉的化學成分

2.2.1再生處理

由表3可知，隨著球磨時間增加，稈或葉中的木質素經過LiCl/DMSO體系處理，水中再生后，不同球磨時間下的木質素再生得率均下降，在球磨初期(0.5～2.0 h)，木質素得率在80%以上，隨著球磨的繼續，再生后木質素的保留越來越少，球磨的處理會導致小粒徑或小分子量的木質素產生，并能在LiCl/DMSO溶劑體系處理過程中進一步溶出，木質素的再生得率因此下降。另外發現，在相同球磨的處理條件下，稻草稈中木質素的再生得率要高于葉中的木質素。

表3 再生球磨稻草各部位木質素和灰分含量(基于原料)Table 3 Content of lignin and ash of regenerated straw samples (based on raw material)

注：木質素得率，%=再生后原料中總木質素含量×再生得率/再生前球磨原料中的總木質素含量×100%。灰分得率，%=再生后原料中灰分含量×再生得率/再生前球磨原料中的灰分含量×100%。

Note： lignin yield,% = total lignin content in regenerated raw material × regenerated yield/total lignin content in original raw material × 100%; ash yield,% = ash content in regenerated raw material × regenerated yield/ash content in original raw material × 100%.

球磨時間的長短決定球磨作用的程度，其對稻草中葉、稈部位中灰分的保留也有一定的影響，葉中灰分的得率在整個球磨時間內幾乎保持在65%左右，灰分的保留隨球磨時間長短的變化不大，說明LiCl/DMSO溶劑體系的處理對于葉中灰分的留著幾乎沒有影響。與葉中灰分溶出相比，稻草稈中的灰分更容易溶出，在球磨時間0.5～8.0 h，只有近30%灰分在LiCl/DMSO溶劑體系再生過程中保留。

由表4可知，隨著球磨時間的增加，高聚糖的再生得率也逐漸下降，球磨作用會產生小分子的糖，在LiCl/DMSO溶劑體系的再生中會進一步溶出，使得高聚糖再生得率下降。但在球磨4.0 h時，高聚糖含量仍在440.0 mg/g以上，結合表3，球磨4.0 h草粉經溶劑再生后仍能得到高得率的木質素和高聚糖。

表4 球磨稻草再生后各部位高聚糖含量(基于原料)Table 4 Polysccharide content of regenerated straw samples (based on raw material)

注：高聚糖得率，%=再生后原料中高聚糖總糖含量×再生得率/再生前球磨原料中的高聚糖總糖含量×100%。

Note： polysaccharide yield,% = total polysaccharide content in regenerated raw material × regenerated yield/total polysaccharide content in original raw material × 100%.

2.2.2酶水解處理

由表5可知，再生稻草原料隨著球磨時間的延長，其酶水解得率會進一步降低。

Zhang等[23]以球磨木粉為原料，經LiCl/DMSO溶劑體系處理、乙醇再生，分離木質素，但木質素得率比較低。在本研究中將球磨稻草粉經LiCl/DMSO溶劑體系處理，在水中透析再生，隨后進行酶水解得到以木質素為主的殘渣。由表6和表7可知，隨著球磨作用的進一步加強，稻草稈和葉中的木質素的再生得率呈現出下降趨勢，葉子的木質素得率經纖維素酶水解后從74.8%下降至48.7%，稻草稈中木質素的得率從84.6%下降至63.1%，下降的幅度比葉小。與稻草稈相比，葉中木質素在LiCl/DMSO溶劑體系處理過程中溶出較多。木質素經溶劑再生后得率普遍不高，可能是由于稻草木質素中醚鍵鏈接在球磨、再生處理過程中遭到斷裂；也可能是稻草中有部分木質素鏈接到高聚糖的大分子結構上。

表5 再生球磨稻草各部位酶水解殘渣得率 (基于原料)Table 5 Yield of enzymatic hydrolysis residual of regenerated straw samples %

表6 再生稻草各部位酶水解后的木質素和灰分含量(基于原料)Table 6 Lignin and ash content of enzymatic hydrolysis residual of regenerated straw samples (based on raw material)

注：木質素得率，%=酶水解后殘渣中總木質素含量×再生得率×酶水解得率/再生前球磨原料中的總木質素含量×100%。灰分得率，%=酶水解后殘渣中灰分含量×再生得率×酶水解得率/再生前球磨原料中的灰分含量×100%。

Note： lignin yield,% = total lignin content in enzymatic hydrolysized residue × regenerated yield × hydrolysized yield/total lignin content in original raw material × 100%; ash yield,% = ash content in enzymatic hydrolysized residue × regenerated yield × hydrolysized yield/ash content in original raw material × 100%.

再生球磨稻草中的大部分糖都在酶水解過程中生成小分子的糖溶出，見表7。在木質纖維原料進行生物乙醇轉化過程中，原料的預處理是生物煉制中的關鍵。預處理的目的主要是：1)破壞纖維素、木質素、半纖維素之間的連接；2)破壞纖維素內部氫鍵，降低結晶度，促進纖維素結晶無定型化；3)提高底物的孔隙率和比表面積[21-22]。預處理的最終目的都是為了增加纖維素的可及性，使纖維素酶可以進入木質纖維原料內部與高聚糖充分接觸。而且有報道指出木質素的存在會對纖維素酶解過程產生影響，木質素是天然的生物質抗降解屏障，其含量越高，對纖維素和酶的屏蔽作用越大，酶水解效率越低[24-27]。

表7 再生稻草各部位酶水解后的高聚糖含量(基于原料)Table 7 polysaccharide content of enzymatic hydrolysis residual of regenerated straw samples

注：高聚糖得率，%=酶水解后殘渣中高聚糖總含量×再生得率×酶水解得率/再生前球磨原料中的高聚糖總糖含量×100%。

Note： polysaccharide yield，%= total polysaccharide content in enzymatic hydrolysized residue × regenerated yield× hydrolysized yield / total polysaccharide content in original raw material × 100%.

因此，在酶水解之前有必要對纖維原料進行預處理，改善纖維素對酶的可及性。本研究中以球磨稻草為原料，通過LiCl/DMSO溶劑體系潤脹處理、破壞纖維素結晶區，降低結晶度，碳水化合物降解溶出，但木質素含量及結構不受溶劑處理的影響。比較稻草中不同部位的酶解結果可知，相同球磨條件下稻草稈更易于酶解。

2.3 可萃取木質素分析

由圖2可知，隨著球磨時間的增加，球磨稻草中可萃取木質素的含量會進一步增加，經球磨機械處理的作用，里面的木質素有更多裸露出來，草粉顆粒的粒徑越來越小，比表面積越來越大，經溶劑萃取后，可萃取木質素的含量逐漸增加。從圖中可以看出，球磨初期，球磨時間短，可萃取木質素的含量變化小，球磨處理帶來的木質素結構變化也小，基本保留了草粉中原木質素的結構。隨著球磨的繼續，在球磨時間為8.0 h時，稈中的可萃取木質素得率達到33.4%，葉為29.1%，都比球磨初期提高了1倍。Fujimoto等[22,28]認為當球磨設備、球磨條件、或者球磨強度都不一樣時候，球磨時間是不適合作為球磨作用對木質素結構的影響標準。如果球磨樣品中可萃取木質素的得率相同，即使球磨處理條件不同，球磨設備不一樣，也可認為由球磨作用導致的木質素結構變化是一樣的，可建議用球磨樣品的可萃取木質素得率來評判物料的球磨程度。球磨前2 h的草粉在木質素結構上可認為是沒有差異的。

圖2 球磨稻草中各部位的可萃取木質素(EL)
Fig.2 Extractable lignin content of ball milled straw samples

由圖3可知，在球磨初期(0.5～2.0 h)，球磨稻草經再生處理后，有更多的木質素會游離出來，經水透析再生后，更多木質素被留下，因此，有機溶劑萃取后游離木質素的含量也高。相較于再生前，球磨初期稈和葉中的可萃取木質素的含量都有一定的提高，且高于球磨再生前的可萃取木質素含量。對球磨初期的樣品，LiCl/DMSO溶劑體系處理對稻草葉的效果尤其明顯。

圖3 再生球磨稻草中各部位的可萃取木質素(EL)
Fig.3 Extractable lignin content of regenerated straw samples

由圖4可知，再生處理會促進更多的木質素游離出來，再生原料經纖維素酶水解后，更多的高聚糖會溶出，木質素純度也隨之提高，來自高聚糖的阻礙減少了，在溶劑體系中的溶出量會進一步得到提高。球磨作用的程度會影響可萃取木質素的溶出，球磨越激烈，酶水解殘渣中可萃取木質素含量越高，其中稻草稈溶出的木質素更多。

2.4 木質素結構單元的變化

稻草木質素中的結構單元不同于針葉材(以愈創木基為主)，也不同于闊葉材(以愈創木基和紫丁香基為主)，其結構單元包括愈創木基、對羥基苯基及紫丁香基。堿性硝基苯氧化反應一般用于木質素的結構單元分析，未縮合的對羥基苯基、愈創木基和紫丁香基單元在高溫堿性條件下分別氧化為對羥基苯甲醛(H)、香草醛(V)和紫丁香醛(S)。由表8可知，稻草稈中木質素的結構單元包括愈創木基、對羥基苯基及紫丁香基，球磨時間0.5～8.0 h時，其得率均為255.3 mg/g，木質素中未縮合單元在球磨過程中基本沒有變化，S/(V+H)的摩爾比在整個球磨過程中變化不大，因此，球磨時間長短對稻草稈中木質素結構基本單元影響甚微。

圖4 再生球磨稻草酶水解后殘渣中的可萃取木質素(EL)
Fig.4 Extractable lignin of enzymatic hydrolysis residual of regenerated straw samples

表8 稻草稈部位的硝基苯氧化產物的得率及S/(H+V)摩爾比
Table 8 Nitrobenzene oxidation products yields and S/(H+V) molar ratio of internode sample

球磨時間/hMillingtime得率/(mg/g) YieldS/(H+V)原料Original再生Regenerated殘渣Enzymaticresidue原料Original再生Regenerated殘渣Enzymaticresidue0.5255.3255.3225.20.60.60.61.0255.3255.3225.20.60.60.62.0255.3255.3210.20.60.60.64.0255.3225.2195.20.60.60.66.0255.3210.2210.20.60.60.68.0240.2240.2195.20.60.60.6

注：S,紫丁香醛； H， 對羥基苯甲醛；V，香草醛。下同。

Note： S, syringaldehyde; H, p-hydroxybenzaldehyde; V, vanillin. The same below.

在球磨初期(0.5～2.0 h)，再生后稻草稈的硝基苯氧化產物的得率、S/(V+H)比例與未經處理的球磨原料相當，說明再生處理幾乎保留了原料中的未縮合單元的木質素。酶水解后殘渣中木質素的未縮合單元的得率降低，縮合程度有所增加，木質素大分子結構其本身不會在酶水解過程中破壞、溶出，但在纖維素酶水解過程中，會有一些木質素-碳水化合物復合物(LCC)溶出，留在殘渣中的木質素不影響原本木質素的結構分析。

由表9可知，球磨時間的長短對稻草葉中木質素未縮合單元的得率基本沒有影響。不同時間的球磨作用下，球磨稻草葉中木質素結構的未縮合單元含量要低于稻草稈，其縮合程度要高于稈部位。

經LiCl/DMSO溶劑體系再生后，葉中木質素的縮合程度提高了，再生處理后，木質素有約1/5的溶出，溶出部分會帶走部分未縮合單元木質素，使得硝基苯氧化后木質素結構單元的得率降低，縮合程度提高；纖維素酶水解后，部分未縮合木質素隨著LCC的溶出而溶出，酶水解殘渣硝基苯氧化得率隨之降低，縮合程度進一步提高。稻草稈的情況與葉有所不同，主要因為葉和稈在木質素的結構單元的含量、組成和分布上有差異。

表9 稻草葉部位的硝基苯氧化產物的得率及S/(V+H)摩爾比Table 9 Nitrobenzene oxidation products yields and S/(V+H) molar ratio of leaf samples

3 結 論

以脫脂稻草的稈和葉為原料，分別經LiCl/DMSO溶劑體系處理，可得到如下結論：

1)球磨時間的長短會影響稻草中木質素、高聚糖的再生得率，稈中木質素和高聚糖的再生得率比葉部位的高，灰分的保留則較低。球磨原料中灰分的再生能力不受球磨操作條件影響。

2)LiCl/DMSO溶劑體系處理可促進稻草稈和葉木質素的溶出，經過LiCl/DMSO溶劑體系處理的稈更易于進行酶水解。

3) 球磨1.0～8.0 h的原料，經LiCl/DMSO溶劑體系再生和酶水解處理后，分離出的木質素：葉中木質素含原料原本木質素的48.7%～74.6%，葡聚糖為4.7%～13.4%；稈部位中木質素含原料中木質素的63.1%～81.7%，葡聚糖為3.7%～9.0%，都能代表原球磨原料中的木質素。其中從球磨1.0～2.0 h的葉、稈分離出來的木質素得率高、純度高，可用于原料中原木質素的結構解析。