豬ARID5B基因多態性及其與脂肪沉積性狀的相關性分析

吳綠草 董世雄 段夢琪 劉思源 陳 瑩 張 健 嚴飛飛 強巴央宗 商 鵬

(西藏農牧學院 動物科學學院，西藏 林芝 860000)

隨著人民生活水平的提高，對豬肉品質要求日益提升。近年來，廣大育種工作者主要圍繞提高生長速度和瘦肉率等方面進行高強度選擇，卻帶來了肉品質下降的弊端。因此，在不降低生產速度的前提下，提高肉品質是當今育種工作者重點關注的熱點。脂肪沉積性狀是影響豬肉品質的最關鍵因素，而豬肉的嫩度、風味、多汁性等主要與肌內脂肪(Intramuscular fat，IMF)含量相關[1-2]。目前已鑒定出的與豬脂肪沉積相關的基因包括：過氧化物酶增殖物激活受體G(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPARG)、脂肪酸結合蛋白(Fatty acid binding proteins,FABP)、肥胖相關基因(Fat mass and obesity associated gene,FTO)、脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase,FASN)、脂肪細胞決定和分化因子1(Adipocyte determination and differentiation factor-1,ADD1)以及瘦素(Leptin,LP)等[3-9]；在MicroRNA(miRNA)方面發現miR-27、miR-125以及miR-130家族對豬脂肪沉積發揮負調控作用[10]，李美航等[11]研究發現miR-103是豬脂肪沉積的促進因子，對豬脂肪沉積起著正調控作用，并且認為PPARγ基因有助于豬原代脂肪細胞中的脂肪沉積。

富含AT的交互域5B(AT-rich interaction domain 5B,ARID5B)基因位于豬的14 號染色體上，含有7 個外顯子，共編碼945 個氨基酸。ARID基因家族具有高度保守性，包含15 種人類特殊蛋白質，分為7 個亞型，主要在細胞發育，組織特異性基因表達和增殖控制中具有重要作用[12]。目前，多數研究報道了ARID5B與急性淋巴細胞白血病，淋巴腫瘤發生與發展及細胞生長、分化、發育有關[13-14]。ARID5B基因也已被證實參與脂肪的形成，但關于ARID5B基因在脂肪沉積性狀等方面的研究較少，大多集中在小鼠和人類肥胖癥的研究上[15-16]，在豬上的相關研究尚未見報道。本研究團隊前期對藏豬和大白豬肌肉組織進行了轉錄組學(RNA-seq測序技術)和蛋白質組學(Isobaric tags for relative and absolute quantification, iTRAQ蛋白質譜技術)的聯合分析，確定ARID5B為脂肪沉積性狀關鍵差異表達基因[17]，與Muoz等[18]通過轉錄組學鑒定伊比利亞豬背最長肌中差異表達基因的結果一致。

因此，本研究以脂肪沉積性狀存在明顯差異的青藏高原脂肪型豬種—藏豬和典型的瘦肉型豬種—大白豬為研究對象[19]，采用混池測序后單個個體測序的方法和RT-qPCR技術分別對藏豬、大白豬ARID5B基因5′側翼區進行單核苷酸多態性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位點篩選和組織表達差異性分析，旨在探究ARID5B基因對豬脂肪沉積性狀的初步影響，以期為開發脂肪沉積性狀有效遺傳標記及育種工作提供一定的思路和參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用的青藏高原脂肪型豬種—藏豬(TP)來源于西藏農牧學院教學實習牧場，典型的瘦肉型豬種—大白豬(LW)來源于西藏林芝市宇高農業養殖場，采用相同的日糧水平，自由采食的模式飼養。試驗藏豬和大白豬各9頭均為180 日齡的健康去勢公豬，無親緣關系。屠宰后，按照《瘦肉型豬胴體性狀測定技術規范》(NY/T 825—2004)[20]三點法測定背膘厚；采集背脂、背最長肌、肝臟組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于組織表達分析；其中背最長肌1 份用于IMF含量測定，1 份用于總RNA提取。采集藏豬和大白豬69 份耳組織(藏豬33 頭，大白豬36 頭)，置于75%酒精中，-20 ℃冰箱保存，用于基因多態性分析。

1.2 DNA和組織總RNA提取

本試驗采用苯酚-氯仿法提取組織DNA；采用動物組織總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司，DP171221)提取組織總RNA；用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA和RNA的質量、濃度。

1.3 引物設計

1.3.1SNPs篩選與基因分型引物設計

下載GenBank中豬的ARID5B(登錄號NC_010456.4)基因5′側翼區DNA序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物(表1)，用于多態性分析。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用Tris和EDTA配制而成的TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

1.3.2定量引物設計

下載GenBank中豬的ARID5B(登錄號XM_003359209)mRNA序列，以HPRT(登錄號NM_001032376)為內參基因，設計熒光定量引物(表2)，用于組織表達分析。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，用Tris和EDTA配制而成的TE緩沖液溶解，4 ℃保存。

表1 ARID5B基因5′側翼區引物Table 1 Primer sequences for amplifying the 5′-UTR of ARID5B

表2 ARID5B基因和HPRT基因定量引物信息Table 2 ARID5B gene and HPRT gene primers quantitative information

1.4 基因型頻率與基因頻率

ARID5B基因多態性分析采用混池測序，每個品種10 頭，用Chromas Pro和DNAMAN 6.0軟件進行序列比對分析，篩選SNPs位點后，擴大樣本進行個體測序，統計基因型頻率與基因頻率。

1.5 反轉錄和熒光定量PCR

選用一步法cDNA反轉錄試劑盒(北京天根生化科技有限公司，KR180123)對總RNA進行反轉錄，將所得合格的cDNA保存于-20 ℃備用。

以cDNA為模板，對ARID5B和HPRT基因進行擴增，每個樣品設置3個重復。20 μL反應體系，包括SYBR Green Mix(北京天根生化科技有限公司，FP171206)10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，Ranse-free water 7 μL，cDNA模板1 μL。熒光定量PCR擴增程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃ 變性30 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，80 ℃ 檢測熒光，共38 個循環。樣品mRNA的相對表達量使用2-ΔΔCt法[21]進行計算。

1.6 IMF含量測定

采用傳統索氏抽提法測定IMF含量，參照《豬肌肉品質測定技術規范》(NY/T 821—2004)[22]標準執行，最后計算每個樣品的IMF值。

1.7 統計分析

利用SPSS 18.0軟件分別對ARID5B基因表達量進行雙因素(品種和組織)分析以及背膘厚、ARID5B基因背最長肌表達量與IMF含量的相關性(Pearson相關系數)分析，使用Fisher Exact Test對ARID5B基因的基因型頻率和基因頻率進行顯著性檢驗，P<0.05 時差異顯著，P<0.01 時差異極顯著，P>0.05 時差異不顯著；測定結果以“平均值±標準誤”表示。

2 結果與分析

2.1 SNPs檢測

在5′側翼區共發現2 個多態性位點(圖1)，其中在該基因起始密碼子上游2 216 bp位置發現 T/C 突變，記為T-2 216 C(圖1(a))；在起始密碼子上游第2 029～2 036 bp的8 個堿基(ATTTATTT)的插入/缺失突變，記為In-2 029 Del(圖1(b))。在藏豬(TP) 33 個個體，大白豬(LW)36 個個體中，當T-2 216 C位點為T堿基時，在In-2 029 Del位點存在ATTTATTT；C堿基出現時，在In-2 029 Del位點就存在ATTTATTT的缺失。這2 個突變位點緊密連鎖，其中-2 216 T與-2 029 In連鎖，-2 216 C與-2 029 Del連鎖。因此，檢測T-2 216 C的基因型，即可獲悉In-2 029 Del的基因型。

(a) T-2 216C位點T-2 216 C sites; (b) In-2 029 Del位點In-2 029 Del sites
圖1ARID5B基因突變位點測序峰圖
Fig.1 Sequencing peak ofARID5Bgene mutation sites

2.2 ARID5B基因型頻率和等位基因頻率分布

由表3可知，T-2 216 C位點的基因型分布在藏豬和大白豬內均符合Hardy-Weinberg平衡(P≥0.05)；在品種間，T-2 216 C位點的基因型頻率呈極顯著差異(P<0.01)，藏豬群體中的優勢基因型為CC型，大白豬群體中的優勢基因型為TT型。

表3 ARID5B基因多態性位點基因型頻率和等位基因頻率Table 3 ARID5B gene polymorphism loci genotype frequency and gene frequency

2.3 不同組織ARID5B基因相對表達量變化

ARID5B基因在藏豬和大白豬的背脂、背最長肌、肝臟組織的mRNA相對表達量結果見圖2。在相同品種的不同組織中，背最長肌表達量最高，其次是背脂，肝臟則最低；在相同組織的不同品種中，藏豬(TP)ARID5B基因表達量均極顯著低于大白豬(LW)的表達量(P<0.01)，表達趨勢完全一致。

2.4 不同品種豬背膘測定

由表4可知，180 日齡藏豬、大白豬平均體重分別為39.02 和81.54 kg，藏豬體重極顯著低于大白豬(P<0.01)；藏豬、大白豬的平均背膘厚度分別為21.27和15.50 mm，藏豬背膘厚極顯著高于大白豬(P<0.01)。

2.5 不同品種豬IMF含量測定

由表5可知，180 日齡藏豬、大白豬背最長肌IMF含量分別為4.11%和2.28%，藏豬IMF含量極顯著高于大白豬(P<0.01)。

注：*為顯著差異P<0.05,** 為極顯著差異P<0.01 Note： * Significant differenceP<0.05, ** Extremely significant differenceP<0.01
圖2ARID5B基因在TP和LW兩個品種豬背脂、 背最長肌和肝臟中mRNA的相對表達量
Fig.2 Relative expression ofARID5Bgene in backfat, longissimus dorsi muscle and liver of TP And LW pigs

表4 180 日齡藏豬、大白豬背膘測定
Table 4 Backfat measurement of Tibetan pig and Large White pig at 180 days of age

品種Breed體重/kgWeight背膘厚度/mmBackfat measurement藏豬(TP)39.02±2.77 A21.27±1.09 A大白豬(LW)81.54±0.94 B15.50±0.93 B

注：同列數據肩標大寫字母不同表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note： The different capital letters in the same column indicate extremely significant differences between breeds (P<0.01). The same below.

表5 180 日齡藏豬和大白豬背最長肌IMF含量測定Table 5 Determination of IMF in the dorsal longest muscle of Tibetan pig and Large White pig at 180 days of age

2.6 ARID5B基因表達量與背膘厚和IMF含量相關性分析

由表6可知，ARID5B基因在背最長肌中的mRNA相對表達量與背膘厚呈顯著負相關，相關系數為-0.87，差異顯著(P<0.05)，與IMF含量呈顯著負相關，相關系數為-0.87，差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

脂肪是機體重要的組成部分和貯能物質，可以調節機體的能量平衡，動物脂肪的分化與發育是一個復雜的過程，受多基因調控[23]。ARID5B基因表達的蛋白質參與脂肪的生成、肝臟發育的靶基因的轉錄以及RNA聚合酶II啟動子轉錄的負調控[24-26]。Dong等[24]研究報道，ARID5B基因對C/EBPα與PPARγ表達具有調節作用，影響脂肪的生成，結合Claussnitzer[27]和人類CNV(Copy number variation)肥胖癥的研究，發現ARID5B基因在脂肪細胞產熱調節途徑中具有抗肥胖作用[16,28]。推測ARID5B基因在脂肪沉積過程中發揮

表6 ARID5B基因表達量與背膘厚和IMF含量相關性分析Table 6 Analysis of correlation between ARID5B gene expression and backfat thickness and IMF content

注：r，表示相關系數；P<0.05為相關性顯著，P<0.01為相關性極顯著

Note：rindicates correlation coefficient;P<0.05 indicates significant correlation,P<0.01 indicates extremely significant correlation.

負調控作用。本研究發現，藏豬ARID5B基因在背脂、背最長肌和肝臟組織中的mRNA相對表達量極顯著低于大白豬(P<0.01)。藏豬具有IMF含量高，肉品質好，脂肪沉積能力強的特點；大白豬具有高瘦肉率，快生長速度，低脂肪沉積能力的特性，這可能是導致藏豬表達量低于大白豬的主要因素之一。通過對ARID5B基因表達量與背膘厚和IMF含量的檢測發現，背膘厚和IMF含量與ARID5B基因mRNA的相對表達量顯著負相關(P<0.05)，進一步證實了ARID5B基因可能在脂肪沉積過程中發揮負調控作用。ARID5B基因mRNA的相對表達量在背最長肌中最高，其次是背脂，肝臟中最低，推測主要是由于在豬的生長發育過程中，2～6 月齡是肌肉快速生長的階段，6～12 月齡是脂肪的發育高峰期[29]，本試驗采用6 月齡豬為研究對象，處于脂肪組織發育的起始階段，肌肉發育的終止階段，試驗結果符合機體發育規律。

本研究在ARID5B基因5′側翼區發現了2 個新的SNPs(T-2 216 C和In-2 029 Del)位點，且為連鎖突變(即T-2 216 C位點C堿基出現時，In-2 029 Del就存在ATTTATTT缺失)，這2 個突變位點的等位基因頻率和基因型頻率在藏豬與大白豬存在極顯著差異(P<0.01)。梁爽等[30]發現連鎖突變與其抗原表型特征呈現明顯的一致性規律，提出了與表型呈現規律性的SNPs可作為有效分子標記，相對于單堿基突變更為有效。另外，ARID5B基因參與RNA聚合酶II啟動子轉錄的負調控[25]，因此，T-2 216 C 位點的C等位基因可能通過抑制ARID5B基因表達，從而增強豬脂肪沉積與IMF含量。

本研究在樣本含量具有統計學意義的情況下，結合前人的研究從DNA和mRNA水平對ARID5B在脂肪沉積中的作用進行了初步探究。本研究表明，ARID5B基因在藏豬和大白豬5′側翼區存在2 個連鎖突變位點，并且ARID5B基因在背最長肌中的相對表達量與豬的背膘厚以及IMF含量呈顯著負相關，推測ARID5B基因可能在豬脂肪沉積中發揮負調控作用，但具體調控機制和功能尚需進一步研究。下一步將開展不同基因型個體和脂肪沉積性狀的關聯性分析。

4 結 論

本試驗通過對ARID5B基因5′側翼區多態性及其組織表達含量與背膘厚、IMF含量關聯分析，發現ARID5B基因mRNA的相對表達量與背膘厚、IMF含量呈顯著負相關，ARID5B基因可能是改善脂肪沉積性狀及肉品質的重要候選基因，發現的SNPs位點可能是豬脂肪沉積性狀的重要分子標記，為進一步探索豬脂肪沉積調控機制和分子輔助育種提供一定的思路和科學依據。