仙人掌超氧化物歧化酶提取、部分純化及其飲料的制備

閔玉濤，宋彥顯，聶卉，馬慶一

1. 鄭州工程技術學院（鄭州 450044）；2. 鄭州輕工業學院（鄭州 450002）

米邦塔仙人掌（Opuntia Milpa Alta）原產于墨西哥，1997年由農業部成功引入我國，20余年來在我國種植廣泛，已成為消費者喜愛的蔬菜。米邦塔仙人掌營養豐富，富含蛋白質、維生素、氨基酸、礦物質、不飽和脂肪酸等營養成分[1-2]。仙人掌中SOD、黃酮、果膠、多糖和纖維素等功能成分含量較多[3-5]，故具有降血糖，減肥、抗衰老、抗氧化、抗癌、保護細胞受損、降血脂等功效[6-9]。同時，仙人掌味道鮮美、口感清新、風味獨特，是制作保健飲料的上佳原料之一。

以仙人掌為原料，以藍莓、靈芝、西瓜、獼猴桃等作為復配原料，開發出的復合飲料和發酵乳制品報道較多[10-14]。仙人掌SOD含量是動物血液的2倍，且安全性高，但仙人掌SOD保健飲料還鮮有報道。利用仙人掌中豐富的SOD開發具有抗炎、抗衰老、抗氧化等功能的保健飲料，具有重要的研究價值和經濟效益。

試驗以仙人掌為原料，提取和部分純化SOD，以黃瓜作為復配材料制備仙人掌SOD功能飲料，為仙人掌資源的深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米邦塔仙人掌（周口扶溝種植園）；黃瓜（毛莊菜市場）；蔗糖（食用級，西糖業有限公司）；乙酸鋅（食用級，天津市科密歐化學試劑有限公司）；乙基麥芽酚（食用級，青島花帝食品配料有限公司）；Sephadex（G-75，Amersham Pharmacia）；乙二胺四乙酸二鈉（分析純，天津市科密歐化學試劑開發中心）；聯苯三酚（分析純，貴州遵義市建強化工有限公司）；聚乙二醇（分析純，派尼市化學試劑廠）；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

組織搗碎勻漿機（JJ-2，金壇市億通電子有限公司）；高速冷凍離心機（GL-22M，賽特湘儀離心機儀器有限公司）；酸度計（HI253臺式，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；自動部分收集器（BSZ-100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）；紫外分光光度計（UV-2100，上海瀘西分析儀器廠有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 仙人掌SOD的提取

稱200 g仙人掌用蒸餾水洗凈，切成3 cm×2 cm的塊，加入18 mL pH 7.8 0.05 mol/L的磷酸緩沖液。勻漿、過濾，濾液在4 ℃下，以8 000 r/min離心10 min。收集上清液460 mL，加入960 mL冷丙酮，放入4 ℃冰箱中過夜。收集沉淀，加入95 mL磷酸緩沖液溶解，總體積108 mL。離心除去不溶物質，收集上清液100 mL。

1.3.2 蛋白質濃度的測定

按照參考文獻[15]采用紫外吸收法測定蛋白質濃度。

1.3.3 酶活力的測定

在pH 8.2、25 ℃條件下，1 mL的反應液中1 min聯苯三酚在325 nm波長處的自氧化速率達50%時的酶量定義為1個活力單位。按照文獻[16]采用聯苯三酚自氧化法測定和計算酶活力。

1.3.4 硫酸銨鹽溶、鹽析

收集的上清液中加入9.54 g固體硫酸銨至飽和度20%，4 ℃冰箱中放置2～3 h。高速離心機離心10 min、10 000 r/min，收集上清液80 mL。再測蛋白質濃度、酶活。添加固體硫酸銨37.52 g至飽和度90%。放入4℃冰箱過夜。以12 000 r/min轉速離心40 min，收集沉淀。加入8 mL磷酸緩沖液溶解即為酶液。測蛋白質濃度、酶活。

1.3.5 透析、反滲透

將酶液移入處理好的透析袋中，在磷酸緩沖液中，4 ℃下透析過夜，不時攪拌。將透析完畢的透析袋，用聚乙二醇覆蓋脫水，待袋內溶液體積濃縮到10 mL左右，取出即為濃縮酶液。

1.3.6 Sephadex G-75凝膠層析純化

凝膠經預處理，裝柱，平衡，將10 mL濃縮酶液一次性裝入事先處理好的Sephadex G-75柱。用磷酸緩沖液洗脫，用自動收集器收集，調整流速，每10 min自動收集一管，每管約5～6 mL。每隔3管測1次酶活，將有酶活的溶液試管合并，再用聚乙二醇反滲透。所得溶液即為部分純化的SOD酶液。

1.3.7 仙人掌SOD功能飲料的制備及檢測

仙人掌SOD功能飲料的制備工藝流程：

1.3.7.1 原材料的選擇與清洗除雜

選擇無病斑、無蟲害、新鮮、綠色、肉質肥厚的仙人掌片和無病蟲害、鮮嫩的黃瓜，清洗除去雜質。

1.3.7.2 切片

仙人掌除刺，去掉仙人掌的表面硬皮后，將其切成30 cm×10 cm薄片。黃瓜去皮后切除兩端掛蒂，切成3～5 cm厚的塊狀。

1.3.7.3 熱燙護色

黃瓜90 ℃熱燙3～5 min，投入0.04%的醋酸鋅護色液，浸泡15 min。

1.3.7.4 原料取汁

經熱燙護色的黃瓜迅速用水冷卻，并將燙漂液沖洗干凈，以1∶1.5（g/mL）加水打漿，制得漿液備用。仙人掌以1∶1.5（g/mL）加水打漿，制得漿液備用。

1.3.7.5 澄清

制得的仙人掌漿液、黃瓜漿液用4層紗布過濾，濾出液置入燒杯中，用磁力攪拌器攪拌30～60 min，4 ℃環境下靜置3～4 h。濾出上清液，棄去沉淀。

1.3.7.6 調配

將稱量好的蔗糖、乙基麥芽酚加入黃瓜汁中，加入檸檬酸調pH 4.0。飲料配方：黃瓜汁100 mL、仙人掌汁100 mL、蔗糖10 g（5%）、檸檬酸0.15 g（0.000 8%）、乙基麥芽酚0.03 g（0.002%）。

1.3.7.7 殺菌

調配好的黃瓜汁裝瓶后采用90 ℃，30 min殺菌，冷卻至室溫。將微波30 s滅菌處理過的仙人掌汁裝入事先殺菌過的黃瓜汁中。

1.3.7.8 測酶活力

按照1.3.3測定飲料中SOD酶活力。

2 結果與分析

2.1 仙人掌SOD的提取純化結果

仙人掌經鹽溶、鹽析、透析和Sephadex G-75層析純化后，酶活力、活力回收率、提純倍數如表1所示。

由表1可知，經提取和部分純化后酶活力的回收率為19.23%，純化倍數9.13。隨著純化步驟的進行，蛋白質和酶活力總量逐漸減少，但SOD比活力逐漸提高。仙人掌SOD粗酶總活力13 760 U，含量豐富，可以仙人掌為原料制備SOD功能飲料。

2.2 Sephadex G-75洗脫曲線

從圖1中可看出，酶活力隨著洗脫體積增加而增高，在緩沖液洗脫體積在80 mL左右，酶活力達到最高。洗脫過程是大分子量組分先被洗脫，小分子量的組分后被洗脫。SOD在50 mL以后逐漸被洗脫出。葡聚糖凝膠（Sephadex）內部具有網狀篩孔。Sephadex G-75凝膠可區分分子量在3 000～70 000 Da之間的分子，SOD分子量在32 000～40 000 Da，可以進入Sephadex G-75的網狀結構，流出時間的長短居中，如圖1中尖峰的位置所示（對應于約83 mL洗脫體積）。

2.3 復合原料的選擇結果

在選擇復合原材料時考慮到飲料的色澤和風味等方面的因素，采用與仙人掌相接近的黃瓜作為飲料的另一種原材料。黃瓜本身的抗褐變能力強，并且在掩蓋仙人掌青澀味方面也起到了一定效果。

表1 酶活力、比活力、活力回收率、提純倍數的測定表

圖1 仙人掌SOD Sephadex G-75洗脫曲線

2.4 熱燙護色結果

在果蔬組織內含有多種酚類物質和多酚氧化酶，在加工過程中，由于組織破壞與空氣接觸，使酚類物質被多酚氧化酶氧化，生成褐色的醌類物質，從而影響外觀，也破壞了風味和營養價值。這種褐變主要來源于酶促褐變，其關鍵作用的因子有酚類底物、酶和氧氣。為保留飲料中SOD酶活力，仙人掌不做漂燙護色處理。黃瓜進行漂燙和護色處理能夠鈍化酶，軟化組織，阻止葉綠素褪色和褐變，并提高出汁率。據文獻報道，黃瓜采用90 ℃熱燙3～5 min，投入0.04%的醋酸鋅溶液（pH 8.0）中護色15 min，效果最佳。

2.5 澄清結果

采取的澄清法是將制備好的黃瓜汁、仙人掌汁分別用磁力攪拌器攪拌30和60 min（仙人掌汁含的果膠多，攪拌時間長，能充分破壞膠體結構，使沉淀物快速地沉淀下來），移入4 ℃冰箱中自然澄清3～4 h，取出濾除沉淀。此法結合自然澄清和冷凍澄清完成。利用此方法制成的飲料證明澄清效果比較滿意，飲料放置一段時間后并無沉淀出現。

2.6 滅菌結果

仙人掌SOD保健飲料，如用熱殺菌進行滅菌，將會導致仙人掌SOD酶活性喪失，所以不能采取傳統熱殺菌技術，需要采用冷殺菌工藝。生物體作為極性介質吸收微波能量后使生物體的蛋白質產生變性凝固，從而達到殺菌目的，且對試驗條件要求低，可以作為仙人掌SOD保健飲料的殺菌方法。

2.7 飲料風味和SOD含量

飲料中所添加的乙基麥芽酚和果糖，前者對苦澀有消殺作用，對特有風味有“乳化作用”，具有抗菌，防腐性能；能有效延長食品儲存期；后者使風味將更醇厚，有利于糖尿病患者和肥胖患者食用。制備的飲料口感細膩，具有仙人掌和黃瓜獨特的清香味；色澤青綠，無肉眼可見沉淀，其具有的SOD酶活力為2 U/mL。

3 結論

米邦塔食用仙人掌經勻漿、硫酸銨鹽溶、鹽析、Sephadex G-75凝膠層析等方法提取純化SOD，提取粗酶活力137.60 U/mL，經提取純化后SOD比活力413.68 U/mL，純化倍數和活力回收率分別為9.25和19.13%。仙人掌和黃瓜經清洗除雜、切片、熱燙護色、榨汁、澄清、調配和殺菌等工藝，制備仙人掌SOD保健飲料，飲料口感細膩，具有仙人掌和黃瓜獨特的清香味；色澤青綠，無肉眼可見沉淀，SOD酶活力為2 U/mL，可為仙人掌的深加工技術提供參考，提高仙人掌的附加值。