響應面法優化黃精總蛋白提取工藝及其氨基酸含量

王遠茜，陳艷艷，宋宸宇，白雪媛，王思明*

1. 長春中醫藥大學（長春 130117）；2. 吉林省腫瘤醫院康復中心（長春 130012）

黃精（Polygonatum sibiricumRed.）為百合科（Liliaceae）黃精屬（PolygonatumMill.）滇黃精、多花黃精的干燥根狀莖。按其形狀，通常又被稱為雞頭黃精、仙人余糧、老虎姜等。自然條件下，黃精最適合生長于表層水分豐富、富含腐蝕質的沙質土壤以及蔭蔽高海拔地區[1]。

藥用黃精在藥食同源方面以及健康保健領域的作用愈發突出，具備廣泛的藥用價值、重要的研究意義。較多報道針對黃精多糖等[2-5]成分進行研究，中醫古籍記載鮮黃精具有補益作用，因此考察黃精總蛋白是否具有一定的生物學活性。此次試驗主要考察報道較少的黃精蛋白提取工藝[6]。基于基礎研究發現，在堿提液中黃精蛋白的溶出率較水提液高，試驗采用堿液提取的方法提取黃精總蛋白，因此試驗從pH為7開始考察，所得出的試驗結果也驗證了這一結論。

響應面方法（Response surface methology，簡稱RSM）是數學方法和統計方法結合的產物，是用來對所感興趣的響應受多個變量影響的問題進行建模和分析，其最終目的是優化該響應值。比正交試驗的方法更加可信、詳細與準確[7]。

1 試驗材料及儀器

1.1 材料與試劑

鮮黃精（湖南湘西）；NaOH（北京化工廠，分析純）；HCl（北京化工廠，分析純）；Bradford蛋白定量試劑盒（天根，TIANGEN）；磷酸鹽緩沖液（PBS，由長春中醫藥大學人參科學研究院中醫藥大健康產業中心配制）。

1.2 試驗儀器與設備

FE20 pH計（美國梅特勒-托利多公司）；Gentrifuge 5804R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；Infinite M200 Pro多功能酶標儀（瑞士Tecan公司）；AL204電子天平（美國梅特勒-托利多公司）；全營養蔬果破壁機；電子精密分析天平。

2 試驗方法與結果

2.1 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法測定蛋白含量。將牛血清白蛋白（BSA）作為標準品，分別吸取0，1，2，3，4，5和6 μL BSA標準溶液進行試驗，使用酶標儀來測定吸光度，以蛋白質的質量濃度（μg/μL）為橫坐標，吸光度A為縱坐標，繪制蛋白質標準曲線。所建立的回歸方程為：Y=0.077 9X+0.008 3（R2=0.998 4）。蛋白質標準曲線見圖1。

圖1 蛋白質標準曲線

2.2 黃精蛋白單因素試驗

以黃精蛋白提取率為衡量指標，分別以pH、提取時間、料液比、提取次數為影響因素以設計黃精蛋白單因素試驗[8]。

2.2.1 黃精蛋白等電點的確定

精密稱取黃精6份，每份20.00 g，按料液比1∶5（g/mL）將堿提取液（pH 9）放置于4 ℃冰箱浸提，過濾之后用HCl分別調pH至2.0，3.0，3.5，4.0，4.5和5.0，酸沉4 h[9]，提取次數1次，沉淀離心后凍干，分別稱定不同pH條件下各個樣品蛋白質的含量，含量最多的即為等電點，試驗中酸沉的pH 3.5為黃精的等電點[10]。

由圖2可以看出，當pH＜3.5時，蛋白提取率隨著pH的增加而逐漸上升；當pH為3.5時，黃精蛋白含量最高，此時酸沉效果最好；當pH＞3.5時，隨著pH的增加，蛋白質的提取率降低。綜上可知，pH 3.5為黃精的等電點[11]。

圖2 等電點pH與提取率的關系

2.2.2 堿提pH對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在料液比1∶5（g/mL），pH分別為7，8，9，10和11的條件下放置于4 ℃冰箱浸提4 h，過濾之后用HCl分別調pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，然后使用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量[12]。

由圖3可知，蛋白質的提取率在pH 9時最高，在pH 9之前蛋白提取率隨著pH增大而增加，pH 10時所提取蛋白含量減少，故選擇pH 9作為最后提取的pH。

圖3 堿液pH與提取率的關系

2.2.3 料液比對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比分別為1∶3，1∶5，1∶10，1∶15和1∶20（g/mL）的條件下放置于4℃冰箱浸提4 h，過濾之后用HCl分別調pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，蛋白質含量使用考馬斯亮藍法測定。

由圖4可知，料液比1∶5（g/mL）時蛋白提取率最高，之后隨著提取液體積增大提取率逐漸下降[13]。

2.2.4 提取時間對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的條件下，分別堿提2，4，8，12和24 h，過濾之后用HCl分別調pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，然后使用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量。

由圖5可以明確看出，當提取時間為4 h時，黃精蛋白提取效果最好。在4 h前，黃精蛋白隨著提取時間延長溶出較多，在4 h時達到最大，4 h后的提取率逐步趨于平緩，分析原因可能是隨著提取時間的增長[14]，有效成分溶出量達到飽和，故試驗選擇4 h作為最佳提取方案。

圖4 不同料液比對提取率的影響

圖5 提取時間對提取率的影響

2.2.5 提取次數對黃精蛋白提取率的影響

取20 g鮮黃精，在pH 9，料液比1∶5（g/mL）的條件下堿提4 h，分別提取1，2和3次，過濾之后用HCl分別調pH至3.5，過濾后再離心，取上清液密封保存，蛋白質含量使用考馬斯亮藍法測定。

由圖6可以看出，提取2次較提取1次提取率增大，之后隨著提取次數的增加，蛋白的提取率沒有太大變化，同時考慮到成本及工作效率的因素，提取次數確定為2次。

圖6 不同提取次數對提取率的影響

2.3 蛋白提取條件的響應面試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用Design Export 8.0.6的Box-Behnken中心組合試驗設計響應原理，進行響應面試驗設計，每個組合平行3次，提取率取平均值，因素和水平見表1[15]，試驗結果見表2。

表1 響應面試驗因素水平

表2 試驗方案及結果

2.4 統計學方法

每個樣品處理重復3次，結果取平均值。采用Excel 2007進行數據散點圖和統計分析。Design Expert 8.0.6軟件進行響應面設計及結果分析。

得擬合方程為：Y=+0.81-0.015A+0.021B+0.083C+0.012D+0.022AB-0.013AD+0.000 02BC-0.000 02BD-0.075CD-0.23A2-0.16B2-0.13C2-0.2D2。

該試驗模型的顯著性分析見表3。模型F=121.28，Pr＞F＜0.000 1，說明此回歸模型是極顯著的。方程失擬項F=0.916 4，Pr＞F＞0.05，失擬項相對于純誤差影響不顯著，說明回歸模型與實測值擬合度較好，可以使用該回歸方程代替試驗真實點分析試驗結果。各因素的影響大小為：提取次數＞提取時間＞料液比＞pH。通過F檢驗來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高，對試驗指標的影響越大，PB、PC均小于0.01，說明提取時間、提取次數對黃精蛋白提取率的影響極顯著。

表3 響應面試驗方差分析

表4 回歸模型方差分析

2.5 響應面結果分析

利用Design Expert 8.0.6，根據回歸方程，生成等高線和響應面圖，并考察擬合響應曲面的形狀，分析pH、液料比、提取時間、提取次數對黃精蛋白提取率的影響。

從圖7～圖12可見，四個因素在所選范圍內存在極值，即等高線中最小橢圓的中心點。圖10中，CD交互作用顯著，與F值結果一致。

圖7 提取時間與提取次數交互作用的響應面和等高線圖

圖8 提取時間與料液比交互作用的響應面和等高線圖

圖9 提取次數與料液比交互作用的響應面和等高線圖

圖10 提取次數與pH交互作用的響應面和等高線圖

圖11 pH與料液比交互作用的響應面和等高線圖

圖12 pH與提取時間比交互作用的響應面和等高線圖

2.6 驗證試驗

經軟件分析優化，由該模型得到的最佳優化條件為：料液比1∶5.587（g/mL）、提取時間3.494 h、提取次數1.832次、pH 9.673。且預測黃精蛋白提取率理論值為0.57%。考慮到實際操作的可能性，將試驗條件修正為：料液比為1∶5.6（g/mL）、提取時間3.5 h、提取次數2次、pH 9.7。在該修正條件下進行3次提取試驗，平均蛋白質提取率為0.51%，接近理論值。表明該數學模型可用于優化黃精蛋白質提取過程。

2.7 高效液相色譜法測定黃精中氨基酸的方法與結果

采用高效液相色譜法，對黃精凍干品中所含氨基酸進行測定[16]。分別將各種必需或非必需的氨基酸進針，通過對比總氨基酸液相圖和黃精蛋白凍干品液相圖相同的保留時間峰可以得到黃精所含的氨基酸的種類。

2.7.1 色譜條件

色譜柱，GL Sciences WP 300 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A，甲醇；流動相B，0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液。樣品采用梯度洗脫程序，洗脫量見表5。流速1.0 mL·min-1，紫外檢測波長360 nm，柱溫20 ℃，進樣量10 μL。

表5 柱前衍生化高效液相指紋圖譜流動相洗脫程序

2.7.2 供試品溶液的制備

取0.1 g黃精凍干粉，使用流動相溶解黃精凍干粉，精密量取2 mL續濾液置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的1.5%（質量分數）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風烘箱中避光反應1 h，取出，冷卻，再加濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為供試品溶液。

2.7.3 陰性對照品的制備

精密量取2 mL蒸餾水置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的1.5%（質量分數）的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風烘箱中避光反應1 h，取出，冷卻，再加濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL，定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為衍生劑陰性對照品溶液。

2.7.4 對照品溶液的制備

分別稱取約10 mg各氨基酸對照品，精密稱定，置于10 mL凍干管中，加蒸餾水至10 mL，得到濃度為1 g·L-1的氨基酸對照品溶液。對各氨基酸對照品溶液進行衍生化，取2 mL各氨基酸對照品溶液置于5 mL凍干管中，再加入1 mL的質量分數1.5%的2, 4-二硝基氟苯（DNFB）乙腈溶液、1 mL濃度為0.5 mol·L-1NaHCO3，振蕩搖勻，在60 ℃鼓風烘箱中避光反應1 h，取出，冷卻，再加入濃度為0.1 mol·L-1醋酸鈉緩沖液至5 mL定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，作為氨基酸對照品溶液。

圖13 混合氨基酸色譜圖

圖14 黃精色譜圖

圖15 空白色譜圖

由圖13～圖15可以看出，黃精中所含氨基酸有：絲氨酸（保留時間17.903 min）、蘇氨酸（保留時間25.335 min）、脯氨酸（保留時間32.235 min）、纈氨酸（保留時間53.187 min）、苯丙氨酸（保留時間58.553 min）、異亮氨酸（保留時間59.312 min）、亮氨酸（保留時間60.029 min）和酪氨酸（保留時間63.904）。

3 結論

試驗利用響應面分析，對影響因素及其相互作用進行探討，優化提取黃精蛋白的提取工藝，其最佳條件為料液比為1∶5.6（g/mL）、提取時間3.5 h、提取次數2次、pH 9.7。在此修正條件下進行3次提取試驗，蛋白質提取率的平均值為0.51%，與理論值較為接近，表明該數學模型可用于優化黃精蛋白質提取過程。采用高效液相色譜法分析得出黃精蛋白中含有的氨基酸有絲氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸。