轉cry1Ab/c水稻環介導等溫擴增快速檢測方法

王鎵璇，胡昱萱，吳海星，檀建新*

河北農業大學食品科技學院（保定 071001）

轉基因作物（Genetically modified crops，GMC）是應用轉基因技術，將已知的一種或幾種基因序列（DNA）構建到載體上，將構建好后的載體轉移到植物（如玉米、棉花、水稻等）細胞內，從而實現基因重組，表達相應的多肽或蛋白質產物，得到轉基因作物[1]。轉基因作物根據其性能可分為4個種類：一是轉Bt農作物[2]，可有效抵抗蟲害，同時減少農藥使用和殘留；二是抗除草劑農作物[3]，減輕除草劑對農作物的危害；三是抗病毒農作物，防治病毒侵害農作物，從而增加其產量；四是營養增強型農作物，其特定營養組分含量更高，其正成為飼料市場中越來越重要的部分[4]。在轉基因作物帶給人們革命性創新的同時，轉基因作物對于人體健康安全性和農作物種植過程中對于環境安全性同樣引起各國的重視[5]。源于對其安全性的擔憂，市場廣泛需要建立一種簡便、靈敏的檢測作物中是否含有轉基因成分的方法。

目前國內檢測轉基因成分的方法[6]主要分為以下幾種：一是以蛋白質為標準的檢測技術，分為酶聯免疫吸附法[7]和蛋白質印記雜交法[8]，蛋白質在加工過程中容易變性，從而失去作為檢測指標的意義，影響試驗結果；二是基因芯片[9]和生物傳感器檢測方法[10]；三是近紅外光譜技術[11]；四是聚合酶鏈式反應（PCR）方法[12]和LAMP方法。其中前三種方法技術要求高、儀器設備昂貴、實用性低。PCR方法需PCR儀，成本高、耗費時間長且靈敏度較低；相比較，環介導等溫擴增法（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000年開發的一種恒溫核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異引物，利用一種鏈，置換DNA聚合酶，在恒溫條件短時間內即可完成核酸擴增反應，具有高靈敏度、強特異性、操作簡單等優點[13]，該反應被廣泛應用于微生物病原體的檢測[14]和進出口中轉基因食品的檢測中。此次試驗建立了以LAMP反應為基礎的水稻中cry1Ab/c為目的基因快速檢測方法，以觀察濁度、電泳法、熒光染料法[15]三種方法進行結果分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

抗蟲轉基因水稻‘TT51-1’、抗蟲轉基因水稻‘科豐六號’為天津市農業科學院農產品檢驗與標準鑒定所保存；普通水稻‘4021-P6’‘9311’‘TP309-P6’由河北農業大學生命科學學院劉麗娟老師惠贈。BstDNA聚合酶、10X Bst buffer、MgSO4，分析純，購自New England Bio Labs公司；dNTPs購自Solarbio公司；Taq酶Mix、DNA分子量Marker購自大連寶生物公司。

PCR儀，Biometra Co.，Ltd.；電泳儀，北京市六一儀器廠；紫外分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；高速臺式離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；凝膠成像系統，北京市六一儀器廠；電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；連續可調微量移液器，德國Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組提取

總基因的提取方法參考CTAB方法[16]。利用分光光度計測定所提取到的核酸在260～280 nm處的吸光度，確定其純度和濃度，將濃度調整為50 ng/μL，保存在-20 ℃，備用。按上述方法提取抗蟲轉基因水稻TT51、抗蟲轉基因水稻科豐六號，普通水稻‘4021-P6’‘9311’‘TP309-P6’的DNA，并調整濃度用作LAMP檢測cry1Ab/c特異性的模板；同時用分析天平為十萬分之一的規格稱取轉基因水稻和非轉基因水稻，以一定的比例進行混合，使轉基因水稻占總質量的2.5%，1%，0.5%，0.1%，0.05%，0.01%和0.005%，完全混勻，提取DNA，濃度統一調至50 ng/μL，用作LAMP檢測cry1Ab/c靈敏度的模板。

1.2.2 DNA模板質量控制

為確定檢測結果是否可靠及準確，首先判斷待測樣品的內標基因是否為水稻的蔗糖磷酸合酶（SPS基因，Genbank編號U33175），從而監控提取的DNA質量。PCR反應水稻的內標基因SPS是按照農業部953號公告-6-2007進行擴增，正向引物SPS-F1的序列為：5’-TTGCGCCTGAACGGATAT-3’；反向引物SPS-R1序列為：5’-GGAGAAGCACTGGACGAGG-3’[17]。PCR擴增反應體系共25 μL，包括上下游引物F3和B3各0.6 mmol/L，2.5 μL DNA模板，12.5 μL mix，用滅菌雙蒸水補足至25 μL。PCR反應在PCR儀中進行，檢測水稻內標準基因SPS的PCR反應程序為94 ℃預變性5 min，進入循環，94 ℃變性40 s，54 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，最后72 ℃終延伸6 min；PCR擴增產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.3 LAMP引物設計篩選與合成

使用來源于轉基因水稻外源基因Bt cry1Ab/c的人工改造序列，運用引物設計軟件Primer Explorer Version 4在線進行LAMP引物設計。篩選4條特異性引物：兩個外引物分別為上游外引物（F3）和下游外引物（B3）；兩個內引物分別為上游內引物（FIP）和下游內引物（BIP），FIP由F1的互補序列和正向序列F2構成，BIP由B1的互補序列和正向序列B2構成。特異性引物所對應的目的基因片段從358～575區域218 bp目的基因片段。引物由華大基因合成（見表1）。

表1 LAMP引物

1.2.4 LAMP反應體系

應用的反應體系共25 μL，包括有內引物（FIP和BIP）各1 mmol/L，外引物（F3和B3）各0.2 mmol/L，2.5 mmol/L dNTPs，0.5 mmol/L MgSO4，8 UBstDNA聚合酶，2 μL DNA模板，2.5 μL 10×Thermo Pol Buffer，用滅菌雙蒸水補足體系至25 μL。LAMP反應過程：95 ℃變性5 min，65 ℃水浴反應60 min，然后80 ℃ 10 min終止反應。肉眼觀察其濁度變化，并高速離心后觀察管底部是否產生白色焦磷酸鎂沉淀。同時，取5 μL擴增產物，與1 μL 6×loading buffer混合均勻，進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，觀察梯形條帶是否正確，以證實LAMP反應是否發生。也可直接加入SYBR Green Ⅰ觀察是否變為綠色，判斷反應是否發生。

1.2.5 PCR反應體系

于PCR儀中進行PCR反應，94 ℃預變性5 min，然后進入循環，94 ℃變性40 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環，最后72 ℃終延伸6 min。結果檢測為5 μL PCR擴增產物，然后進行2%的瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.6 反應條件的優化

LAMP體系中所使用的不同濃度比的內外引物于擴增反應是最為重要的影響因素之一。固定外引物的濃度，改變內引物的濃度，使外引物與內引物的濃度比為1∶5，1∶6，1∶7和1∶8。dNTPs對擴增效率有顯著影響，為DNA合成提供原料和能量，在LAMP體系中dNTPs濃度梯度為0.7，0.8，0.9，1.0，1.1和1.2 mmol/L；LAMP反應特殊之處是合成大量產物的同時，生產副產物焦磷酸鎂白色沉淀。此次試驗反應體DNA聚合酶的活性因子，其濃度對擴增的產量和特異性有顯著影響。濃度過低會降低DNA聚合酶活性，使產物量減少；而濃度過高，酶會催化非特異性擴增，反應的特異性會降低。Mg2+的游離濃度又受到帶負電荷離子基團（如磷酸基團）的影響，因此反應體系中應不含帶負電荷離子基團，LAMP體系中磷酸根的主要來源dNTPs，其濃度的變化會影響Mg2+的濃度。因此在優化反應條件時，已將dNTPs的加入量設為1.0 mmol/L。此次試驗反應體系中把Mg2+濃度依次設為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mmol/L。同時針對試驗中的反應溫度進行探索，設為61，62，63，64，65和66 ℃。

1.2.7 LAMP反應的靈敏度和特異性檢測

以1.2.1提取的DNA模板分別做LAMP和PCR擴增，擴增后分別取5 μL反應物進行凝膠電泳，向剩余的反應物中加入1 μL 100倍SYBR Green Ⅰ熒光染料，充分混勻，觀察顏色變化。SYBR Green Ⅰ是一種直接與dsDNA雙螺旋小溝區域非特異性結合后具有綠色激發波長的染料。在游離狀態下，SYBR Green Ⅰ發出微弱的熒光，一旦與雙鏈DNA結合，熒光會增強1 000倍，如果發生了擴增反應，反應結束后混合液會由橙色變為綠色；如果未發生反應，則反應結束后混合液的顏色仍保持SYBR Green Ⅰ的橙色不變。試驗采用凝膠電泳法和熒光染料法顯示LAMP擴增和PCR擴增的靈敏度和特異性結果，并對LAMP和PCR法進行比較。

2 結果與分析

2.1 水稻模板DNA質量控制

以‘TT51-1’轉基因水稻和非轉基因水稻DNA為模板，對SPS水稻內標基因進行PCR擴增，結果見圖1。轉基因水稻和非轉基因水稻均擴增出大小為277 bp的明顯條帶，與目的產物片段大小一致，可作為進一步檢測應用的模板。

圖1 水稻基因組SPS基因PCR檢測

2.2 LAMP反應條件的優化

LAMP反應條件的優化結果見圖2～圖5。由圖2可知，反應溫度在61～66 ℃區間對反應影響不大，最終選擇為65 ℃；圖3表明dNTPs濃度在1.0～1.2 mmol/L范圍內效果相當，最終選擇1.0 mmol/L；圖4顯示LAMP反應的內外引物比例在1∶5時條帶最亮，因此選擇內外引物比例為1∶5；圖5證明LAMP反應的最佳Mg2+濃度為0.5 mmol/L，由此確立上述參數為最佳LAMP反應體系。

圖2 LAMP反應溫度的優化

圖3 LAMP反應體系中dNTPs濃度優化

圖4 LAMP反應體系中內外引物比例的優化

圖5 LAMP反應體系中Mg2+濃度的優化

2.3 LAMP法檢測cry1Ab/c的靈敏度

LAMP擴增和PCR擴增電泳結果見圖6（A）和圖6（B）。

圖6 LAMP法和PCR法的檢測靈敏度

由圖6（A）可見，泳道1～5均出現LAMP反應特有的階梯狀電泳條帶，最低檢測限可以達到0.05%；由圖6（B）可見，泳道1～3常規PCR均擴增出218 bp大小的特異性條帶，PCR只能擴增濃度在0.5%以上的樣品。電泳結果顯示，此次試驗所建立的LAMP方法的靈敏度是常規PCR的10倍。熒光染料檢測結果（圖6C）與凝膠電泳法LAMP擴增結果一致。

2.4 LAMP法檢測cry1Ab/c的特異性

LAMP法和PCR法測定特異性結果見圖7。

圖7 LAMP法和PCR法的特異性

熒光染料法結果（圖7C）顯示科豐六號反應管呈綠色，與陽性反應管轉基因水稻TT51-1結果一致，表明出現大量擴增產物，為cry1Ab/c陽性結果。非轉基因水稻4021-P6、9311、TP 309-P6的反應管呈淺橙色，與空白對照反應管可視結果一致，表明引物未能與模板配對擴增，無產物生成，為cry1Ab/c陰性結果。凝膠電泳分析（圖7A和圖7B）結果顯示科豐六號有明顯階梯狀條帶，與陽性對照TT51-1完全相同。其余三個樣品無條帶出現，與空白對照結果一致，該電泳結果與LAMP擴增后直接加入SYBR GREEN I熒光染料的結果是一致的。

3 討論與結論

用LAMP法檢測水稻中是否含有轉基因成分需要以下四方面的準備：第一，分析檢測水稻中插入的改造后crylAb/c基因的序列；第二，從轉基因水稻中提取DNA來作為反應的模板；第三，針對該水稻品種設計4條特異性引物；最后，優化該法中一系列有關反應條件，得到最優用于檢測的反應體系。此次試驗對象為轉基因水稻，以其內標準基因SPS基因為靶基因，根據文獻合成特定引物，建立了以內標準基因SPS基因能否實現PCR擴增來判斷從水稻中提取模板DNA質量優劣的方法。同樣運用引物設計軟件設計出針對crylAb/c基因的LAMP特異性引物。通過優化影響LAMP反應的各種因素，確立了快速檢測轉基因水稻的LAMP反應體系：Mg2+濃度為0.5 mmol/L，dNTPs濃度為1.0 mmol/L，上、下游內引物FIP、BIP濃度均為1 mmol/L，上、下游外引物F3、B3濃度均為0.2 mmol/L，8 U Bst DNA聚合酶大片段的添加量為0.7 μL，模板DNA濃度為50 ng/μL，反應溫度為65 ℃，反應時間為60 min。采用上述建立的優化后LAMP體系進行靈敏度試驗，以PCR方法作對比試驗，結果顯示LAMP方法最低檢測限度可以達到0.05%，而PCR方法最低檢測限在0.5%，即LAMP方法檢出限比傳統PCR法低10倍。用LAMP法對轉基因和非轉基因水稻進行特異性檢測，電泳結果與熒光呈色結果一致。LAMP法比PCR法檢測更方便快捷，體現在擴增時間更短（LAMP法只需60 min；PCR需100 min）、儀器設備簡單（LAMP法只需用恒溫水浴鍋在恒溫條件下即可擴增；PCR法需昂貴的PCR儀，并且反復變性實現擴增）、結果檢測更方便（LAMP法可以直接添加SYBR Green Ⅰ熒光染料，通過可視結果判斷；PCR法通過普通的瓊脂糖凝膠電泳法，時間比前者長且操作時會接觸具有致癌性的EB，一定程度上有潛在的風險危害）、檢測靈敏度更高。基于以上一系列的顯著特性，運用LAMP法對轉基因水稻快速檢測有較強的優越性、可操作性、簡便性，在市場或基層試驗中有著較為廣泛的應用前景。