多酚氧化酶的分離純化及生理功能的研究進展

韓倩云，王坤立，溫馨，王笑園，吳嘉斕，倪元穎*

1. 中國農業大學食品科學與營養工程學院（北京 100083）；2. 國家果蔬加工工程技術研究中心（北京 100083）

多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是一類廣泛存在于動物、植物、細菌和真菌體內的銅結合酶，在食品工業、醫藥工業、廢水處理等領域有著重要應用。在有氧的條件下，多酚氧化酶能將組織中內源性酚類物質氧化成鄰醌，醌類物質聚合并與細胞內蛋白質氨基酸結合，形成黑色或褐色物質從而導致組織褐變[1]。除此之外，多酚氧化酶能夠保護生物體免受生物和非生物脅迫[2]。由于多酚氧化酶基因家族及其表達的復雜性，使得不同來源及同一品種不同類型多酚氧化酶的性質差異顯著。擬綜述多酚氧化酶的分離提取方法，比較不同來源PPO的生理特性，以期為深入研究多酚氧化酶與酶促褐變提供參考。

1 PPO的來源與功能

多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要內源性酶，細胞化學和細胞免疫化學分析發現多酚氧化酶是一種質體酶，存在于正常細胞的光合組織（如葉綠體內囊體的囊泡）和非光合組織質體中（如馬鈴薯塊莖細胞的造粉體）[3-4]。植物在細胞質中合成PPO前體，通過兩個步驟將PPO運輸到葉綠體中，首先依靠N末端的轉運肽將高分子量的PPO導入葉綠體基質，利用基質肽酶將轉運肽切除，隨后依賴光的作用將PPO導入類囊體中成為一個較低分子量的成熟酶蛋白[5-7]。所有位于葉綠體內PPO的特征是前體蛋白必須含有轉運肽，通過基質肽酶的切除，以使PPO到達葉綠體中的指定位置并進行表征[8]。大量研究表明，前體和成熟態PPO的分子量分別約為68和60 kDa，其比例受到植物的種類、年齡和生長條件等多種因素的影響[6]。褐變通常是由多酚氧化酶引起的，隨后是由衰老、損傷、病蟲害和病原體的侵襲造成細胞損傷。多酚氧化酶通過兩個氧化步驟將酚類物質轉化為鄰醌，第一步是現有的羥基發生鄰位羥基化（“單酚氧化酶”或“單酚酶”活性，也稱為羥化酶或甲酚酶活性），第二步是鄰二羥基苯氧化為鄰苯醌（“二酚氧化酶”或“二酚酶活性”，也稱為兒茶酚酶或氧化酶活性）[6,9]。根據特定底物及其作用機理，多酚氧化酶可分為三類：酪氨酸酶、兒茶酚氧化酶和漆酶。酪氨酸酶具有甲酚酶和兒茶酚酶活性；兒茶酚酶也稱為雙酚氧化酶，能將鄰二酚催化氧化為鄰醌；漆酶則通過自由基催化反應機制氧化一系列芳香族化合物。多酚氧化酶一般是指兒茶酚氧化酶和漆酶的統稱[1]。當植物體受到外界壓力、傷害、病原體或食草動物侵襲時，也可以誘導PPO的活動水平[10-12]。

2 PPO的提取和純化

基于酶活性、純化倍數、蛋白濃度和酶的應用，產生了一系列的分離純化方法。在大多數的研究中，一般采用鹽沉淀法、溫度誘導分離法和色譜法對PPO進行提取和純化。三相分離、雙水相萃取、等電點沉淀法、圓盤電泳等新方法也被逐漸采用。以下列出的大多數方法都與酶的提取效率相關。

2.1 表面活性劑的使用

表面活性劑可以在水溶液中加速膠束的形成，膠束具有疏水性核心區域，可用于大部分酚類、脂類、單寧類和非極性蛋白質的提取[9]。在粗酶液的提取中，Triton X-114是最常見的一種非離子表面活性劑，它不僅提供一個溫和的蛋白溶解環境而且避免蛋白質發生變性。通過后續的離心步驟可以清除表面活性劑，親水性蛋白也能被快速分離。如表1所示，添加1.5%～4%的Triton X-114或Triton X-100可以提高純化倍數，提取效率與表面活性劑的電荷和疏水性指數有關[13-16]。非離子型表面活性劑如Triton X-114具有較低的疏水性指數，與離子型表面活性劑相比效率更高[17]。添加表面活性劑的提取方法不僅工藝簡單、耗時短，還可以最大限度地去除酚類物質來提高PPO的穩定性。

雙水相萃取和三相分離法作為一種簡單經濟的操作方法，可同時進行生物大分子的提取和純化[18]。雙水相萃取是以水溶性聚合物、鹽-聚合物或鹽-醇的方式形成不同的兩相，三相分離法是將硫酸銨等鹽類和丁醇等水溶性醇類物質添加到提取液中形成三相[19]。這兩種方法在PPO的分離中可以提高純化效率，但是提取過程中聚合物不能被很好地回收利用，在PPO分離純化的相關文獻中很少被報道[20]。

表1 表面活性劑對不同來源PPO提取的影響

2.2 溶劑沉淀法

溶劑法的目的是用于沉淀蛋白。常用的有機溶劑有乙醇和丙酮，該方法直接應用于勻漿混合物。有機溶劑能將PPO從不同緩沖液中分離出來，由于它們會導致蛋白質結構的變化且通常需要在非常低的溫度下（-20 ℃）進行[21]，所以有機溶劑沉淀法的應用范圍有限。硫酸銨鹽是目前最常用的蛋白質沉淀劑[22-24]。蛋白質表面有親水和疏水區域，過量添加硫酸銨鹽會增加其表面張力從而增加蛋白質的疏水相互作用，使其發生沉淀，這種現象稱為鹽析作用[25]。不同分子量大小的蛋白質所需的硫酸銨沉淀濃度不同，大多數研究結果表明50%～85%的硫酸銨鹽濃度用于提取PPO的效果最佳[26-30]（表2）。鹽析作用雖然會導致蛋白質構象的變化，但不會使蛋白質發生變性。為了保持酶活性，提取過程通常是在較低（4 ℃）溫度條件下進行的，后續的試驗中可通過添加SDS來提高酶活性[13]。

表2 硫酸銨沉淀對不同來源PPO提取的影響

2.3 色譜法

蛋白質分子由于自身性質的特殊性，可通過色譜的方法進行純化。常用的色譜方法主要有離子交換色譜（IEX）、凝膠過濾（GF）、疏水相互作用（HIC）、反相色譜（RPC）和親和色譜（AC）等[31]。色譜法的選擇取決于多酚氧化酶的類型、電荷、分子量和雜質等。為了獲得高純度的目的蛋白，通常會將兩種或兩種以上的色譜法相結合進行操作[32-33]。如表3所示，通過離子交換色譜和凝膠過濾色譜，山藥、花椰菜、人參果中PPO的純化倍數分別提高了76.2，66和51倍[23-24,34]，富士蘋果PPO僅用了一種色譜法，其純化倍數也提高了64.3倍[25]，說明利用色譜法可以有效純化多酚氧化酶。為了保證酶活性，大部分試驗選擇pH在6～8范圍內的洗脫液，通過逐步的線性梯度洗脫以減少蛋白酶的損失。在進行色譜法之前，采用溫度誘導分離法和雙水相等提取方法，可以進一步增加酶的回收率[15,25,35]。色譜法可以有效實現高純度PPO的純化，為了提高其活性回收率，可以通過數學建模的方式優化色譜分離條件。

3 PPO的理化性質

由于多酚氧化酶重要的生理意義，其性質受到研究者的關注，分子量、溫度、pH、底物特異性和抑制劑作用等特征被廣泛研究。

3.1 分子量與結構

植物PPO主要由轉運肽、Cu原子結合區域和疏水區域三部分組成[36-37]。轉運肽是葉綠體蛋白的典型特征，主要作用是指導PPO進入類囊體膜，分子量約為4～9 kDa；Cu原子結合區是PPO的主要功能區域，具有高度保守性且分子量約為40 kDa，大多數植物、動物、細菌和真菌PPO具有兩個Cu原子結合區（CuA和CuB），其中CuA的保守性大于CuB；Cu原子結合區對PPO的結構和構象起到維持作用，主要是由一個耦合的雙核3型銅中心組成，漆酶則含有4個銅離子組成的三核中心[38]。C-末端是疏水性的，其結構區域屏蔽了PPO的活性位點，因此在正常生理條件下，酶活性非常低[6]。由于PPO來源廣泛以及基因的復雜性，其分離純化和結晶的難度較大，因此高級結構的詳細信息仍未被發現。目前，從歌海娜葡萄（Vitis vinifera）中分離出的多酚氧化酶的晶體結構已經得到發現，X-射線分析發現，多酚氧化酶是以α-螺旋為主的二級結構，與組氨酸結合的銅離子活性位點位于螺旋束的中心位置[39]。

由于多酚氧化酶的不同存在形式及同工酶的存在，不同植物、同一植物不同部位及同一部位的PPO分子量存在差異。多酚氧化酶的活性不受SDS的干擾，分子量的測定通常采用SDS-PAGE電泳法與已知分子量的蛋白質進行比較[40]。如表3所示，不同來源PPO的分子量大致在45～130 kDa之間，在某些情況下可以觀察到PPO存在多個條帶，說明同一來源的PPO中存在不同的亞型[41-42]。

3.2 最適溫度和pH

酸堿介質會影響酶活性位點基團的電離，從而改變活性位點的正確構象或阻礙酶-底物結合的催化反應[43]。植物PPO的最佳pH因植物來源的不同而存在差異，但是一般在4.5～7.5之間（表4）。一些PPO顯示了兩個最佳pH，這是由于提取物中存在不同的PPO亞型[44-45]。溫度是催化PPO活性的另一個重要因素，低溫條件會降低反應分子的活動速率，高溫下酶分子的結構完整性受到破壞和變性。溫度的改變也會影響氧氣的溶解度，進而影響酶促褐變。PPO的最適溫度在8～70 ℃之間，其變化取決于植物來源和底物類型[46-50]。

表3 采用不同色譜方法純化不同來源的PPO

3.3 底物特異性和抑制劑

酚類物質是PPO的關鍵底物，酶活性與酚類物質的種類有關[51]。鄰苯二酚是目前應用最廣泛的底物，研究表明，PPO的底物特異性與植物品種有關（表5）[52-54]。抑制劑作為控制酶促褐變的有效手段被廣泛研究，根據其作用機理，可分為六類：（1）還原劑（抗壞血酸及其類似物、亞硫酸鹽等）；（2）螯合劑（乙二胺四乙酸乙酯、疊氮鈉等）；（3）絡合劑（環糊精、殼聚糖等）；（4）酸類物質（抗壞血酸、檸檬酸等）；（5）酶抑制劑（底物類似物、鹵化物等）；（6）酶處理劑（蛋白酶、鄰甲基轉移酶等）[55]。這些化合物通過消除反應過程中的參與元素如酶、底物、銅原子或反應中間產物來降低或抑制褐變的反應速率。不同來源的PPO與抑制劑的反應相似，但是其抑制效果可能會有顯著差異。

表5 不同來源PPO的底物特異性和最佳抑制劑

4 結語與展望

多項研究發現，鹽沉淀法、色譜法、溫度誘導法、三相分離法和雙水相法是多酚氧化酶最常用的分離純化方法，為了提高酶活性和提取效率，親和層析、超濾或金屬結合等方法可用于后續試驗。近年來研究發現眾多水果中的多酚氧化酶主要以結合態的形式存在，如蘋果中可溶態只占了8%～15%[42]。膜結合態的多酚氧化酶與葉綠體內囊體膜結合，處于低活性狀態，在外界環境的刺激下，膜系統受到破壞或膜的通透性發生改變，結合態的多酚氧化酶會逐漸轉化為可溶態，使多酚氧化酶的酶活提高。植物中結合態多酚氧化酶負責細胞內初始酶量的積累，說明了結合態多酚氧化酶研究的重要性，但是國內外對可溶態多酚氧化酶的分離和性質研究較多，對結合態多酚氧化酶未展開系統性的研究，其作用機理未被完全闡明，一些核心問題仍未被解決[56-57]。現今分子生物學已被廣泛應用于酶的功能，但是關于該酶的潛伏期現象以及其在體內是如何轉化為活性形式和控制潛伏態向活性態轉化的作用機理尚不清楚[58]。關于多酚氧化酶與底物的相互作用以及在不同環境中它們是如何相互影響還需要進一步研究[59]。多酚氧化酶在應對病原體和食草動物的侵襲以及防御和應激反應之間的相關性已經被證實，但是多酚氧化酶是如何增強植物抗病性的作用機理還有待進一步研究[60]。目前關于多酚氧化酶在除葉綠體外的其他細胞器中的定位，在植物和真菌細胞中不同發育階段的功能和活性水平仍是研究的重點[61]。多酚氧化酶在食品加工和褐變反應中有著重要作用，未來的研究仍應更多地關注酶的作用機制，以期深入推進多酚氧化酶對植物體生理變化規律的研究。