液液萃取-HPLC法測定食品中黃曲霉毒素B1

馬海峰，陶唐平，方林明，劉成林，單平平，陳輝德*

安徽中創(chuàng)食品檢測有限公司（蕪湖 241000）

黃曲霉毒素是一類由黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，目前發(fā)現(xiàn)的有20余種，確定結構的有17種[1-2]。黃曲霉毒素極易污染糧油及其制品，如花生、花生油、玉米及大米等，在眾多黃曲霉毒素中以黃曲霉毒素B1分布最為廣泛，并且是毒性最強的一種，被確認為I類致癌物[3-7]。多數(shù)國家非常重視黃曲霉毒素B1防控，并制定食品中黃曲霉毒素B1的限量標準[8-11]。

食品中黃曲霉毒素B1常用的檢測方法有薄層色譜（TLC）法、酶聯(lián)免疫（ELISA）法、高效液相色譜（HPLC）法及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）法[12-20]等。TLC是檢測黃曲霉毒素B1的經(jīng)典方法，但前處理繁瑣，易受雜質(zhì)干擾并且定量起來較為困難。ELISA法檢測過程比較簡便，但有可能產(chǎn)生假陽性或假陰性結果，檢測準確度有待提高。HPLC-MS法檢測結果準確，檢出限低，但儀器價格昂貴，不易普及。因此通常采用HPLC法測定黃曲霉毒素B1。

HPLC法測定黃曲霉毒素B1過程中，為了排除提取液中的雜質(zhì)對分離和檢測干擾，需要采用免疫親和柱[19-20]或?qū)Ｓ霉滔噍腿≈鵞21]凈化，成本較高。試驗基于液液萃取對提取液進行凈化，并考察流動相組成和提取溶劑比例對結果的影響，驗證不同基質(zhì)的加標回收率和精密度；建立一種操作方便，靈敏度好，準確性高的黃曲霉毒素B1高效液相色譜檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

液相色譜儀配熒光檢測器（LC-20A，SHIMADZU）；電子分析天平（ME-204，METTLER TOLEDO）；超聲波清洗機（KQ-800DE，昆山市超聲儀器有限公司）；渦旋混合器（Lab dancer，IKA）；氮吹儀（N1，上海屹堯科技有限公司）；均質(zhì)器（T25，IKA）；超純水機（Milli-Q，Millipore）；高速離心機（TDZ5-WS，湘儀離心機儀器有限公司）；有機系濾頭（0.22 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

甲醇、乙腈、三氯甲烷、正己烷（色譜純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；黃曲霉毒素B1標準儲備溶液（3 μg/mL，美國o2si標準品公司）；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、碘（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；流動相用水（GB/T 6682規(guī)定的一級水）。

1.2 黃曲霉毒素B1標準系列工作溶液的配制

用初始流動相將黃曲霉毒素B1標準溶液逐級稀釋，最終得到0.1，0.5，2.5，5.0，10.0，25.0和50.0 ng/mL的黃曲霉毒素B1標準系列工作溶液。

1.3 色譜條件

Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，體積比）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量50 μL；柱后衍生系統(tǒng)（衍生溶液，0.05%碘溶液；衍生溶液流速0.2 mL/min；衍生反應管溫度70 ℃）；熒光檢測器（激發(fā)波長360 nm，發(fā)射波長440 nm）。

1.4 樣品的預處理

1.4.1 提取

準確稱取5 g左右試樣于50 mL塑料離心管中，加入10.0 mL乙腈-水（85∶15，V/V）混合提取液，渦旋混勻1 min后，水浴超聲30 min。冷卻至室溫后，加入2 mL亞鐵氰化鉀溶液（92 g/L）和2 mL乙酸鋅溶液（183 g/L），混勻后靜置10 min。于離心機中以5 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。于殘渣中加入5.0 mL上述提取液，重復提取1次，合并2次提取液于同一25 mL容量瓶中，并定容至刻度。（液體樣品直接加乙腈定容至25 mL）。

1.4.2 凈化與濃縮

準確吸取5.0 mL上清液，加入5 mL正己烷，渦旋2 min后棄去上層溶液（如產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，可于離心機中4 000 r/min離心5 min）。于上述溶液中加入5 mL三氯甲烷，充分渦旋3 min，以5 000 r/min離心10 min，將三氯甲烷層轉(zhuǎn)移到另一離心管中。重復萃取1次，合并2次萃取液于60 ℃水浴中氮吹至干。用初始流動相復溶并定容至1.0 mL，過0.22 μm濾膜后以備測定。

1.4.3 測定

將凈化后的樣液注入液相色譜儀中，在與標準系列工作液相同的儀器條件下測定峰面積，根據(jù)外標法比較定量。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

采用的凈化方式是液液萃取，相比于免疫親和柱或?qū)Ｓ霉滔噍腿≈鶃碚f，液液萃取凈化法得到的凈化液中可能會殘留一些雜質(zhì)，從而對檢測造成干擾[22-23]。為滿足實際檢測需求，通過考察甲醇、乙腈與水之間不同比例組成，并結合檢測效率最終確定以甲醇-乙腈-水（15∶20∶65，體積比）作為流動相，等度洗脫且流速設置為1.0 mL/min。圖1為此流動相條件下的黃曲霉毒素B1標準系列工作液色譜圖。

圖1 黃曲霉毒素B1標準系列工作液色譜圖

2.2 標準曲線及方法檢出限

將1.2中的黃曲霉毒素B1標準系列工作溶液分別注入液相色譜儀進行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，見圖2。在0.1～50 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好線性關系，線性回歸方程為y=74 178.3x-7 972.1，擬合系數(shù)為0.999 97。以3倍信噪比（S/N=3）計算儀器檢出限，結合檢測前處理過程計算黃曲霉毒素B1的方法檢出限為0.02 μg/kg。

圖2 黃曲霉毒素B1標準曲線

2.3 樣品的前處理探究

2.3.1 提取溶劑的選擇

黃曲霉毒素B1易溶于甲醇、乙腈和三氯甲烷等溶劑，通常采用含有一定比例甲醇或乙腈水溶液提取樣品中的黃曲霉毒素B1。以空白花生樣品為基質(zhì)（加標量20 μg/kg），選用乙腈-水作為提取溶劑，分別探究不同比例的乙腈-水（90∶10，85∶15，80∶20，75∶25，70∶30，60∶40和50∶50，體積比）對目標物提取率的影響，結果見圖3。乙腈與水體積比85∶15時，提取率最高為85.6%。

圖3 不同比例的乙腈-水提取液對花生樣品中黃曲霉毒素B1的提取率比較

2.3.2 凈化方式的選擇

提取液中黃曲霉毒素B1常用的凈化方法有免疫親和柱法[19-20]，專用固相萃取柱法[21]和液液分配法[22-23]等。前兩者雖凈化效果優(yōu)越，但耗時長，價格高，有一定局限性。因此試驗采用液液分配法進行凈化，在提取液中加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅除去蛋白質(zhì)，加入正己烷進行渦旋，分離脂溶性雜質(zhì)。在樣液中添加三氯甲烷進行目標物的萃取，濃縮、定容，采用柱后碘衍生-高效液相色譜熒光檢測器進行檢測。從圖4可以看出，色譜圖背景干凈，花生樣品本底無目標峰，加標樣中目標峰與雜峰分離明顯，說明液液萃取有較好的凈化作用。液液分配法可以凈化的特點主要有：提取液中加入蛋白沉淀劑可以除去提取液中的蛋白質(zhì)；黃曲霉毒素B1難溶于正己烷，利用這一特性可以加入正己烷除去脂溶性雜質(zhì)；黃曲霉毒素B1易溶于三氯甲烷，加入三氯甲烷后利用分配系數(shù)的差異將目標物轉(zhuǎn)移到三氯甲烷中，起到進一步凈化作用。

圖4 花生空白樣品及加標樣品色譜圖

2.3.3 加標回收試驗及精密度測定

取花生、玉米、黃豆、大豆油、醬油、腐乳、辣椒、嬰幼兒米粉等不同基質(zhì)的樣品，分別加入低（0.4 μg/kg）、中（4.0 μg/kg）、高（40 μg/kg）濃度的黃曲霉毒素B1標準溶液，并按上述方法檢測，各基質(zhì)樣品中的黃曲霉毒素B1的加標回收率結果見表1。由表1可得，所選的樣品本底中黃曲霉毒素B1都未檢出；加標量0.4，4.0和40 μg/kg時，回收率范圍分別為75.9%～89.6%，78.5%～90.4%和82.1%～94.7%；每個加標量的相對標準偏差（RSD，n=6）分別為1.1%～5.4%，0.5%～5.2%和0.1%～1.8%。由此可見，該方法檢測的準確性和重復性良好，能滿足分析測試要求。

表1 不同基質(zhì)中加標回收率和精密度分析（n=6）

3 結論

試驗建立一種簡單快速的測定食品中黃曲霉毒素B1方法，樣品提取液經(jīng)液液萃取凈化、濃縮及定容后，用柱后碘衍生-高效液相色譜檢測。利用該法對花生、玉米及黃豆等8種樣品進行驗證，結果證明方法無明顯雜質(zhì)干擾，并且準確性和重復性良好。此方法與傳統(tǒng)高效液相色譜法測定黃曲霉毒素B1相比，操作方便，靈敏度好，準確性高，成本低廉，可推廣用于食品中黃曲霉毒素B1檢測。