UPLC-Q/Orbitrap MS法檢測水產品中12種抗生素殘留

李濤，譚璐*，徐文泱，楊滔，王芳斌

1. 湖南省食品質量監督檢驗研究院，食品安全監測與預警湖南省重點實驗室（長沙 410111）；2. 長沙商貿旅游職業技術學院（長沙 410004）

水產品具有味道鮮美、營養豐富、易消化吸收等優點，是一種優質動物蛋白食物來源，深受人們喜愛。漁業環境污染和藥物的濫用嚴重影響水產品的質量和食品安全。大環內酯類抗生素是以大環內酯為母核，與分子糖通過糖苷鍵連接的一類抗生素[1]，對革蘭氏陽性菌及支原體有較強的抗菌活性[2-3]。四環素類抗生素是由放線菌產生的一類光譜抗生素，具有共同多環并四苯羧基酰胺的衍生物，能夠抑制細菌蛋白質的合成，被廣泛應用于細菌感染疾病的治療[4-5]。大環內酯類和四環素類抗生素在畜禽養殖和水產養殖過程中廣泛使用，在生態環境大量殘留，會導致水產品中抗生素殘留，通過食物鏈進入人體，嚴重影響人類健康[6-8]。為保障食品安全，農業部對水產品中大環內酯類和四環素類抗生素限量值進行了規定[9]。目前，大環內酯類和四環素類的檢測方法主要有液相色譜法[10-11]、液相色譜質譜法[12-14]、微生物法[15]、電化學法[16-17]等。微生物法存在特異性差，難以準確定性定量等缺點；高效液相色譜對于獸殘檢出種類有較大局限性；液相色譜質譜法較為普遍。

四極桿/軌道阱高分辨質譜（Q Exactive Focus）是近年來發展起來的新式的質譜，具有高分辨率和高質量精度的特點，可以實現常規質量測定，能實現異構體或結構類似的物質的區別鑒定以及未知物的確證，現已在農藥殘留分析[18]、獸藥殘留分析[19]和保健食品非法添加[20]等領域應用。試驗利用四極桿/軌道阱高分辨質譜聯用系統，建立了水產品中7種大環內酯類和5種四環素抗生素化合物的快速篩查方法，使用精確質量數及其二級質譜定性，大幅提升定性準確性，降低基質干擾影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Q Exactive Focus液相色譜-質譜聯用系統（美國Thermo Fisher Scientific）；Hypersil Gold 色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm，美國Thermo Fisher Scientific）。

生鮮草魚（市售）。乙腈（色譜純，上海安譜）；甲醇（色譜純，上海安譜）；甲酸（色譜純，上海國藥）；乙酸銨（分析純，上海國藥）；泰樂菌素、替米考星、羅紅霉素、克拉霉素、紅霉素、林可霉素、米諾環素、美他環素、金霉素、強力霉素標準品（德國Dr公司）；交沙霉素、差向四環素（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 樣品的制備

樣品取可食用部分混勻，精密稱取2.0 g混勻后樣品，置于50 mL離心管中，加入25.0 mL 80%乙腈0.1 mol/L Na2EDTA-McIlvaine溶液，振蕩搖勻處理30 min，冷凍離心，過0.22 μm濾膜，上機測定。

1.3 液相色譜條件

色譜柱：Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）；流動相A，0.1%甲酸水溶液；流動相B，乙腈；采用梯度洗脫模式進樣，梯度洗脫程序詳見表1；流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積5 μL。

表1 梯度洗脫程序

1.4 質譜條件

離子源HESI，毛細管電壓3 000 V，掃描模式PRM/Targeted-MS2，掃描范圍m/z100～950，分辨率（R）35 000；電噴霧離子源溫度320 ℃，氣化溫度350 ℃，鞘氣壓（N2）40 arb，輔助氣壓（N2）15 arb，離子傳輸管溫度320 ℃，噴霧電壓4.0 kV。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 色譜柱的選擇

在相同流動相、梯度洗脫程序及相同色譜條件下，分別選擇Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）、Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）和Hypersil Gold C8色譜柱色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）對12種抗生素化合物進行色譜分離。結果顯示，3種色譜柱對大環內酯類和四環素類抗生素能進行有效分離，其中Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）分離效果最優，因此采用Hypersil Gold C18色譜柱（150 mm×2.1 mm，3 μm）。

2.1.2 流動相的選擇

在相同的洗脫程序和相同色譜柱下，無機流動相分別選擇水溶液、0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙酸銨（5 mmol/L），有機流動相選擇乙腈考察分離效果。結果顯示，水溶液-乙腈分離峰形較差，0.1%甲酸水溶液-乙腈和0.1%甲酸乙酸銨（5 mmol/L）-乙腈流動相均對12種抗生素分離效果良好，流動相中加入0.1%甲酸可顯著提高目標物電離效果，提高質譜響應，乙酸銨未明顯改善目標化合物的分離與質譜響應，為減少乙酸銨離子對于質譜的污染，采用0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相體系。通過優化試驗，確定采用梯度洗脫程序。圖1為12種抗生素標準溶液的提取定量色譜圖，顯示化合物之間得到有效分離。

圖1 標準溶液中12種抗生素化合物定量離子色譜圖

2.2 質譜條件的選擇

依據目標物化學分子量，在四極桿質量分析器的分析窗口，進行質譜全掃描分析，得到目標物母離子信息，再分別設置低、中、高碰撞電壓，檢測碎片離子。取標準品溶液直接進質譜，得到目標化合物的母離子參數，在母離子參數基礎上，設置碰撞電壓，軌道阱自動檢測子離子，12種抗生素質譜參數見表2。

表2 12種化合物的離子選擇參數表

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

分別精密稱取空白草魚，按樣品制備方法制備基質提取液，以基質提取液為稀釋液，配制基質標準溶液，濃度分別為2.0，5.0，10.0，15.0，20.0和50.0 ng/mL，以峰面積的響應值Y為縱坐標，標準溶液濃度X（ng/mL）為橫坐標，外標法制作標準曲線。在空白草魚樣品添加低濃度混合標準溶液，按樣品制備方式處理，進液質聯用儀檢測，以3倍和10倍信噪比計算檢出限和定量限。12種抗生素的線性范圍、檢出限和定量限見表3。12種大環內酯藥物在2.0～50 ng/mL濃度范圍內線性關系良好，線性回歸系數均在0.996以上，7種大環內酯類抗生素的檢出限在0.073～2.4 μg/kg之間，低于SN/T 1777.2—2007的規定（檢出限20 μg/kg），5種四環素類抗生素的檢出限在1.9～17 μg/kg之間，低于GB/T 21317—2007的規定（檢出限50 μg/kg）；定量限在0.24～50 μg/kg之間。

表3 12種化合物的線性方程、相關系數、檢出限和定量限

2.4 準確度和精密度

在空白草魚樣品中加入混合標準溶液，加標后樣品濃度分別為10.0，20.0和100.0 μg/kg，每個濃度樣品制備6份，測定12種抗生素的濃度，計算回收率和RSD值。由表4可知，當加標濃度為10.0 μg/kg時，回收率為83.1%～94.0%，精密度RSD為3.2%～5.6%；當加標濃度為20.0 μg/kg時，回收率為86.1%～95.7%，精密度RSD為1.6%～4.8%；當加標濃度為100.0 μg/kg時，回收率為88.2%～94.5%，精密度RSD為0.8%～3.8%。

表4 12種化合物的回收率和精密度

2.5 實際樣品的檢測

應用此次試驗所建立的檢驗方法對市場采購的15個鮮活水產品進行檢測，采用保留時間進行定性，結合離子豐度比和二級特征離子進行確證，均未檢出陽性樣品。

3 討論與結論

UPLC-Q-Orbitrap質譜具有高分辨率和高質量精度的特點，可用于高通量篩查，同時也可含量測定。此次試驗建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質譜測定水產品中12種抗生素，并進行了方法學驗證。該方法簡單高效、靈敏度高，為水產品中大環內酯類和四環素類抗生素檢測提供方法參考，也對現有國家標準檢測大環內酯類和四環素類抗生素具有有力補充。