GC-MS/MS法測定水果、蔬菜中敵草快的殘留量

陳盧濤，朱萌萌，劉小羽，黎斌，俞璐萍，杜啟偉

1. 綠城農科檢測技術有限公司（杭州 310000）；2. 浙江工業大學（杭州 310000）

敵草快（Diquat dibromide），是在1955年由英國ICI公司開發的一種聯吡啶類除草劑，對闊葉雜草有很強的防除能力，被廣泛應用于水生雜草的防除[1]。敵草快作為一種水溶性非常大的農藥，由于其良好的除草催枯作用，近年來從旱地作物轉向水稻等作物上大規模使用[2]。楊亞哲等[3]研究表明，敵草快通過干擾植物細胞膜，破壞光合作用，對藻類和溞類具有急性毒性；鮑偉光等[4]研究表明，敵草快可對育肥豬腸道造成嚴重損傷并減弱腸道的消化功能。

國內外對敵草快農藥的檢測分析方法主要包括氣相色譜（GC-FID）法[5-6]、氣相色譜-質譜[7-9]（GCMS）法、液相色譜（HPLC）法[10]、液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法[11-12]、毛細管電泳色譜法[13]、表面增強拉曼散射（SERS）法[14-15]。由于敵草快以季銨鹽類形式存在，具有很強的極性，難揮發，因而很少直接用氣相色譜或氣相色譜-質譜法測定，需要先進行衍生化將其轉化為揮發性化合物。試驗擬采用5%的氯化鎳溶液作為催化劑，比較硼氫化鈉和硼氫化鉀用于敵草快衍生化反應的優劣，并結合GC-MS/MS方法，探究一種操作簡便、試驗成本低、分析速度快、結果準確可靠的方法，用于水果、蔬菜中敵草快殘留量的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

敵草快標準品（純度≥99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）；硼氫化鈉、硼氫化鉀（含量≥97.0%，上海凌峰化學試劑有限公司）；無水硫酸鈉（含量≥99.0%，上海凌峰化學試劑有限公司）；六水合氯化鎳（5%水溶液，取5 g溶解到100.0 mL去離子水，上海凌峰化學試劑有限公司）；中性氧化鋁（100～200目，國藥集團化學試劑有限公司）；鹽酸、氫氧化鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；正己烷（色譜純，美國J.T. Baker公司）；試驗所用水均為去離子水；微孔有機濾膜（0.22 μm）。

1.2 儀器與設備

GC-2010 plus氣相色譜儀配TQ 8040質譜儀，VF-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，日本Shimadzu公司）；BSA2202S電子天平（德國Sartorius公司）；漩渦混合器（美國Henry Troemner公司）；KQ5200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；ST-16R離心機（美國Thermo Fisher公司）；CHK-121臺式精密酸度計（北京昌科儀自動化科技有限公司）。

1.3 試驗條件

1.3.1 色譜條件

進樣口溫度，250 ℃；載氣，高純氦氣；碰撞氣，高純氬氣，純度≥99.999%；柱流量1.0 mL/min；進樣方式，不分流進樣，1.0 min后開閥；進樣量，1 μL；定量方法，外標法。升溫程序：80 ℃保持0 min，以40 ℃/min升至280 ℃，保持1 min。

1.3.2 質譜條件

色譜-質譜接口溫度，280 ℃；電離方式，EI；電離能量，70 eV；離子源溫度，230 ℃；檢測器電壓，0.98 kV（+0.4 kV）；測定方式，MRM多重反應監測模式；定量、定性離子、碰撞能量等參數見表1。

表1 敵草快質譜檢測參數

1.4 試驗步驟

1.4.1 提取

稱取2.00 g（精確至0.01 g）蔬菜或水果樣品于15 mL離心管中，加入4.0 mL純凈水浸泡0.5 h，渦旋器振蕩3.0 min，超聲提取30 min，待衍生。

1.4.2 衍生化

向上述提取液中加入0.5 mL催化劑5%的氯化鎳溶液，蓋上瓶蓋，渦旋0.5 min，加入20 mg硼氫化鈉，過程中會產生大量氣泡，應小心操作，防溢出。再次蓋上瓶蓋，渦旋0.5 min，放入85 ℃烘箱內反應25 min，冷卻至室溫后待凈化。

1.4.3 凈化

向上述衍生液中加入0.5 g中性氧化鋁，渦旋3 min，準確加入1.0 mL正己烷后再次渦旋3 min，以8 000 r/min下離心3.0 min，取上清液，加入0.1 g無水硫酸鈉后過膜，供氣相色譜-串聯質譜檢測。

1.4.4 標準溶液的配制

稱取0.010 0 g敵草快，用去離子水定容至25.0 mL，分別得到約400 mg/L標準儲備溶液；用去離子水稀釋為50.0 mg/L標準工作溶液，于0～4 ℃保存。

2 結果與分析

2.1 氣相色譜-質譜條件的優化

在電子轟擊離子源（EI）檢測模式下對敵草快進行一級質譜分析（Q3 Scan）。在質譜圖中選擇質荷比較大，絕對強度較大的離子為前體離子；設定3～45 eV（每3 eV一個間隔）的碰撞能量，對選定的前體離子峰進行二級質譜分析（產物離子掃描），根據二級質譜圖，選擇離子強度最大的為定量離子，離子強度次之的為定性離子。敵草快經硼氫化鈉/氯化鎳還原反應，轉化為沸點較低的物質1, 1-乙基-2, 2-聯哌啶。經觀察，該物質存在順反同分異構體，在串級質譜上會出現兩個峰，且3個離子對比率相似，雖與GB/T 5009.221—2008《糧谷中敵草快殘留量的測定》中出現單峰不同，但與高利娜等[9]采用固相微萃取結合氣質聯用法測定血漿中敵草快的結果一致，圖1為使用優化后的氣相色譜質譜條件采集敵草快（100 μg/L）標準溶液MRM質譜圖。

圖1 敵草快MRM色譜圖

2.2 衍生化試劑的選擇

敵草快具有較高的沸點（＞300 ℃）和一定的極性，通常需要衍生化反應后再進行氣相色譜質譜分析，試驗比較硼氫化鈉和硼氫化鉀2種衍生化試劑對敵草快衍生化反應的效率和適宜性。

在15 mL離心管中加入20.0 μL 50.0 mg/L敵草快標準儲備液，分別添加5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0和60.0 mg 2種衍生化試劑，在常溫條件下，按照1.4.2的衍生化方法進行衍生30 min，并將最終體積定容為1.0 mL上機分析。結果表明（見圖2），隨著硼氫化鈉添加量增加，敵草快衍生化產物響應逐漸提高，添加量增加到10.0 mg時，衍生化產物含量呈穩定趨勢。隨著硼氫化鉀添加量增加，敵草快衍生化產物響應逐漸提高，添加量增加到10.0 mg時，衍生化產物含量呈穩定趨勢。為保證衍生化反應完全，選擇硼氫化鈉和硼氫化鉀的添加量20.0 mg，且此時兩者衍生化合物含量也趨于一致。綜合考慮試驗成本及衍生化產物的響應，選擇硼氫化鈉添加量20.0 mg。

圖2 2種衍生化試劑添加量對衍生化效率的影響比較

2.3 衍生化條件的優化

2.3.1 衍生溫度的選擇

敵草快在不同衍生溫度下衍生效率差別較大，試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生時間30 min，正己烷為提取溶劑，比較不同衍生溫度的衍生效率。稱取1.0 g蘋果樣品，添加20.0 μL 50.0 mg/L敵草快標準工作液和4.0 mL去離子水，通過衍生和提取，比較不同溫度條件下的衍生效率。結果表明（見圖3），敵草快受不同衍生溫度影響較大，隨著溫度增大，衍生效率逐漸提高。溫度增加到80 ℃時，衍生化產物含量呈穩定趨勢。綜合考慮，選擇80 ℃為最佳衍生溫度。

圖3 溫度對衍生效果的影響

2.3.2 衍生時間的選擇

敵草快在不同衍生時間下衍生效率差別較大，試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生溫度80 ℃，正己烷為提取溶劑，比較不同衍生時間的衍生效率。稱取1.0 g蘋果樣品，添加20.0 μL 50.0 mg/L的敵草快標準工作液和4.0 mL去離子水，通過衍生和提取，比較不同衍生時間下的衍生效率。結果表明（見圖4），敵草快受不同衍生時間影響較大，隨著時間延長，衍生效率逐漸提高。時間增加到25 min時，衍生化產物含量呈穩定趨勢。綜合考慮，選擇最佳衍生時間25 min。

圖4 時間對衍生效果的影響

2.3.3 凈化試劑的選擇

敵草快在衍生化后產生大量黑色物質，對儀器分析產生較大干擾。試驗以硼氫化鈉為衍生化試劑，衍生溫度80 ℃，衍生時間25 min，正己烷為提取溶劑，考察中性氧化鋁的凈化效果。稱取1.0 g蘋果樣品，添加4.0 mL去離子水，衍生后加入0.5 g中性氧化鋁，渦旋3 min后加入1 mL正己烷提取，比較凈化前后的總離子流圖情況。結果表明（見圖5），中性氧化鋁有較好的凈化效果。

圖5 凈化前后總離子流圖

2.4 基質效應的考察

基質效應（ME）指樣品中除分析物以外的其它成分對待測物測定值的影響，即基質對分析方法準確測定分析物能力的干擾。試驗前處理衍生過程產生大量黑色物質，可能對目標物的響應產生一定的影響，按照Stahnke中的添加法定量評價基質效應強度，分別測定空白提取液與純溶劑中添加相同濃度分析物的離子響應強度，考察在添加1.00 mg/kg條件下，不同基質條件對敵草快響應的影響，結果見圖6。

式中：Pm為基質加標峰面積；Ps為純溶劑標準溶液峰面積。

敵草快在蘿卜樣品中存在明顯的基質抑制效應，在其他基質中均存在基質增強效應，這與已知的氣相色譜分析中大多數農藥表現出不同程度的基質增強效應論點相吻合。敵草快在蘋果和辣椒中的基質增強效應均比其它基質要強，可能與蘋果基質中含有較多的糖分、辣椒基質中含有較多的辣椒素有關，在前處理過程中未得到有效凈化。在基質效應存在情況下，試驗選取基質匹配標準曲線定量，可以一定程度上降低基質效應的影響，使定量結果更加準確。

2.5 方法的線性范圍、加標回收率、精密度和定量限

取0.01，0.05，0.10，0.50和1.00 mg/L 5個質量濃度的敵草快，按優化色譜條件進樣1 μL，以峰面積為縱坐標，標準樣品的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線，其線性回歸方程及相關系數見表2，以信噪比S/N≥3估算儀器的檢出限（LOD），S/N≥10估算儀器的定量限（LOQ），結果見表2。

稱取市售的柚子、青菜、火龍果、百香果、柑橘、土豆、蘋果、花菜、辣椒、蘿卜10個樣品，分別添加20，50和100 μg/kg不同水平的敵草快標準溶液進行回收率試驗，每個添加水平重復3次，加標回收結果見表3。敵草快的平均回收率為73.9%～92.8%，相對標準偏差小于9.4%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認的要求。

圖6 不同基質對敵草快的基質效應影響（n=3）

接表3

3 結論

試驗比較硼氫化鈉、硼氫化鉀2種衍生化試劑用于敵草快衍生化反應的優劣，2種衍生化試劑均可用于敵草快的衍生化反應檢測，敵草快經硼氫化鈉或硼氫化鉀衍生后，會產生同分異構體2個峰，采用峰面積加和的方式參與計算，定量更準確。對敵草快在不同基質中的基質效應進行探討，采用基質匹配標準曲線定量可以有效降低基質效應。采用優化后的GCMS/MS方法，在空白樣品添加濃度0.02，0.05和0.10 mg/kg不同水平的敵草快標準溶液，敵草快的平均回收率為71.3%～95.3%，相對標準偏差小于6.4%，符合GB/T 27404—2008附錄F中對檢測方法確認的要求。因此優化后的方法操作簡便，分析速度快，抗干擾能力強，適用于水果、蔬菜中敵草快的定性、定量檢測。