HPLC-MS/MS法測定豬肉和雞肉中12種磺胺殘留

李湘利，劉靜，劉婉，王秋敏

1. 濟寧學院生命科學與工程系，濟寧市特色農產品高值化加工工程技術研究中心（曲阜 273155）；2. 山東嘉源檢測技術有限公司，濟寧市食品安全云檢測工程技術研究中心（濟寧 272100）

磺胺類藥物（Sulfonamides，SAs）是具有對氨基苯磺酰胺結構的藥物總稱，多有顯著的抗菌活性[1]，是治療尿路感染、耳部感染、支氣管炎、皮膚和軟組織感染的重要抗生素，被廣泛應用于畜禽養殖領域[2]。通過任何途徑攝入的磺胺類藥物都會在人體中蓄積，導致機體過敏、造血紊亂、泌尿系統損害等[3]。磺胺類藥物常用分析方法有高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜（GC）法、高效毛細管電泳（HPCE）法、酶聯免疫分析（ELISA）法、生物傳感器免疫分析（BIA）法、高效液相色譜串聯質譜（HPLC-MS/MS）法、氣相色譜質譜（GC/MS）法、超臨界流體色譜（SFC）法和微生物法等[4]。其中，HPLC-MS/MS法具有靈敏度高、選擇性強等優勢，用于復雜樣品分析檢測，可省去分離純化代謝物樣品的繁瑣步驟[5]；根據藥物原型成分的質譜裂解規律，可迅速推測并確定待測成分的結構信息，分析鑒定痕量成分[6]。

豬肉和雞肉是最為常見的動物性食品原料之一，其磺胺類藥物殘留易在人體內蓄積[7]。為此，試驗以豬肉、雞肉為材料，參照GB/T 20759—2006《畜禽肉中十六種磺胺類藥物殘留量的測定液相色譜串-聯質譜法》中磺胺獸藥殘留量的測定方法[8]，測定豬肉和雞肉中12種磺胺類藥物殘留量，旨在建立一種操作簡便、靈敏度高，適于豬肉、雞肉中磺胺類藥物殘留的測定方法，明確磺胺類藥物殘留差別，為開展磺胺類藥物殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉、雞肉，山東嘉源檢測技術有限公司樣品室提供。

乙腈（分析純），天津市科密歐化學試劑有限公司；異丙醇、正乙烷（高效液相色譜純），天津市科密歐化學試劑有限公司；磺胺醋酰（Sulphacetamide，SAA）、磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺噻唑（Sulfathiazole，STZ）、磺胺吡啶（Sulfapyridine，SPD）、磺胺甲基嘧啶（Sulfamerazine，SMR）、磺胺甲噻二唑（Sulfamethizole，SMT）、磺胺二甲嘧啶（Sulfadimidine，SDM）、磺胺甲氧噠嗪（Sulfamethoxypyridazine，SMP）、磺胺-6-甲氧嘧啶（Sulfamonomethoxine，SMM）、磺胺對甲氧嘧啶（Sulfamethoxydiazine，SMD）、磺胺氯噠嗪（Sulfachloropyridazine，SCP）、磺胺甲基異噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ），純度≥99%，北京壇墨質檢科技有限公司。

1.2 儀器與設備

1260-6460-C液相質譜儀，安捷倫（中國）有限公司；TGL-16M高速冷凍離心機，長沙湘儀儀器有限公司；均質器，德國IKA/艾爾；RE-52AA旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；XH-C旋渦混合器，常州賽普實驗儀器廠；XY200-2C電子天平，常州幸運電子有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

準確稱取適量標準品，用甲醇配制成0.1 mg/mL的標準儲備液。用空白樣品提取液配成不同濃度的基質混合標準工作液，質量濃度分別為10，20，40，60，80，100和200 ng/mL，儲備液和工作液均于4 ℃保存。

1.3.2 樣品前處理[8]

25個豬肉樣品編號為Z-1～Z-25；25個雞肉樣品編號為J-1～J-25，樣品于-18 ℃冷凍保存。將豬肉和雞肉樣品攪碎，準確稱取5.00 g，置于50 mL離心管中，加入20 g無水硫酸鈉和20 mL乙腈，均質2 min，再以3 000 r/min離心3 min。上清液轉入100 mL圓底燒瓶中，殘渣再加入20 mL乙腈，均質2 min，再以3 000 r/min離心3 min，合并上清液，向圓底燒瓶中加入10 mL異丙醇；用旋轉蒸發器于50 ℃水浴蒸干，準確加入1 mL正乙烷和1 mL流動相（乙腈+0.01 mol/L的乙酸銨溶液，12+88）溶解燒瓶中的殘渣。轉移至5 mL離心管中，旋渦混合1 min，以3 000 r/min離心3 min，棄上層正乙烷，再加入1 mL正乙烷，重復上述步驟，直至下層水相為透明液體。另稱取7份5.00 g空白豬肉樣品，分別添加1 mL 10，20，40，60，80，100和200 ng/mL磺胺類藥物混合標準溶液，按樣品前處理方法制備空白提取液，下層清液過0.2 μm濾膜，即得上機待測液。

1.3.3 色譜和質譜條件[9]

液相色譜條件：Lichrospher 100RP-18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；進樣量40 μL；流動相為乙腈和0.01 mol/L乙酸銨溶液；流速0.8 mL/min；分流比1∶3。

質譜條件：電子源為電噴霧離子源；離子源溫度350 ℃；電噴霧電壓5 500 V；霧化氣壓0.076 MPa；氣簾氣壓力0.069 MPa；輔助氣流6 L/min；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監測（MRM）模式。12種磺胺類藥物的定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓等參數見表1。

表1 12種磺胺類藥物的定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓

1.3.4 HPLC-MS/MS法測定

用混合標準工作液分別進樣，以工作溶液濃度（10，20，40，60，80，100和200 ng/mL）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量。

2 結果與分析

2.1 標準樣品及樣品添加色譜圖

在設定的條件下對標準樣品進行分析，12種磺胺類藥物標準樣品（100 ng/mL）的MRM色譜圖見圖1。由圖1可知，12種磺胺類藥物分離效果較好，無明顯色譜雜質峰干擾。

2.2 標準工作曲線和線性范圍

測定12種磺胺類藥物標準工作溶液（質量濃度均為10，20，40，60，80，100和200 ng/mL），以峰面積（Y）和對應的質量濃度（X，ng/mL）作圖，結果見表2。在10～200 ng/mL范圍內，各磺胺類藥物的質量濃度與對應的峰面積呈良好線性關系，相關系數r在0.997 3～0.999 7之間，均在0.997 3以上。

圖1 12種磺胺類藥物標準溶液MRM色譜圖

表2 12種磺胺類藥物標準工作曲線的線性方程及相關系數

2.3 方法檢出限

對空白樣品進行加標試驗，以3倍信噪比對應的濃度為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比對應的濃度作為方法定量限（LOQ）[10]。豬肉、雞肉空白基質添加混合標準使用液，在多次重復驗證試驗基礎上將12種磺胺類藥物的方法檢出限定為2 μg/kg，將定量限定為10 μg/kg，遠低于歐、美、日等國家設定的殘留最大限量[11]，說明HPLC-MS/MS法可提高定量分析的選擇性和靈敏度，檢出限較低，滿足分析要求。

2.4 保留時間

12種磺胺類藥物不同濃度標準物質的定量結果見表3。由空白豬肉樣品10，20，40，60，80，100和200 ng/mL（L1～L7）的保留時間可知，各水平下磺胺類藥物保留時間相差不超過0.02 min，出峰時間穩定，表明色譜操作條件穩定，可作為定性分析依據。12種磺胺類藥物從進樣開始到柱后出現該組分濃度極大值的時間分別為磺胺醋酰2.49 min、磺胺嘧啶3.05 min、磺胺噻唑3.44 min、磺胺吡啶3.63 min、磺胺甲基嘧啶3.85 min、磺胺甲噻二唑4.44 min、磺胺二甲嘧啶4.50 min、磺胺甲氧噠嗪4.58 min、磺胺-6-甲氧嘧啶4.58 min、磺胺對甲氧嘧啶4.59 min、磺胺氯噠嗪5.21 min、磺胺甲基異噁唑5.57 min。

表3 12種磺胺類藥物在不同添加水平下的保留時間

2.5 方法的回收率

豬肉和雞肉的空白基質分別加入2，8和20 μg/kg的低、中、高3個濃度的標準溶液，按樣品前處理方法進行前處理以評價加標回收率，結果見表4和表5。結果表明，豬肉樣品空白基質中12種磺胺化合物3個加標水平的平均回收率為94.2%～133.4%，相對標準偏差（RSD）為2.07%～6.11%；雞肉樣品空白基質的平均回收率為89.1%～112.2%，RSD為2.46%～5.87%。這說明使用基質匹配的標準工作曲線進行校正，可消除基質效應影響，對豬肉和雞肉中12種磺胺類藥物殘留的測定有良好的準確度，符合殘留分析要求。

表4 豬肉樣品的添加回收率

表5 雞肉樣品的添加回收率

2.6 實際樣品的測定

選取25個豬肉樣品和25個雞肉樣品測定12種磺胺類藥物的殘留量，結果見表6。各樣品的磺胺類藥物的殘留量相對較低，殘留量低于農業部235號公告規定的動物組織磺胺類藥物殘留限量100 μg/kg[12]；25份豬肉樣品中有3份樣品被檢出磺胺類藥物殘留，其余樣品未檢出，豬肉樣品中被檢測出的4種磺胺類藥物分別為磺胺嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶；25份雞肉樣品中有1份樣品被檢出磺胺嘧啶藥物殘留，其余未測出；所有豬肉和肌肉樣品的磺胺類藥物殘留均未超標，殘留量均合格。

表6 樣品中磺胺類藥物殘留檢測結果

3 結論

采用GB/T 20759—2006液相色譜-串聯質譜法檢測豬肉和雞肉中12種磺胺類藥物殘留，該法在10～200 ng/mL范圍內線性關系良好，相關系數r高于0.997 3，方法檢出限為2 μg/kg，定量限為10 μg/kg；豬肉和雞肉樣品空白基質中12種磺胺藥物3個加標水平（2，8和20 μg/kg）的平均回收率分別為94.2%～133.4%和89.1%～112.2%，RSD分別為2.07%～6.11%和2.46%～5.87%。豬肉中的磺胺類藥物殘留被檢測出的樣品份數高于雞肉的檢出份數，被檢測的12種磺胺類藥物，磺胺嘧啶殘留被檢出，其次是磺胺甲氧噠嗪、磺胺對甲氧嘧啶、磺胺-6-甲氧嘧啶。豬肉樣品中的磺胺類藥物檢出率為12%，雞肉樣品中的磺胺類藥物檢出率為4%。所檢試樣的磺胺類藥物殘留量均未超標，符合國家限量標準（農業部235號公告）規定。GB/T 20759—2006中的方法可對豬肉和雞肉中的磺胺類藥物殘留進行定性和定量分析，具有回收率與準確度高、選擇性好、操作簡便等優點，可滿足檢測和監管需求。