基于網絡藥理學研究補中益氣湯治療糖尿病腎病的潛在作用機制

陳璟 徐墜成 徐貝貝 許惠琴 呂志陽

摘 要：目的：運用網絡藥理學技術預測補中益氣湯治療糖尿病腎病的作用靶點和信號通路，進一步探討補中益氣湯防治糖尿病腎病的物質基礎和潛在作用機制。方法：利用中藥系統藥理學技術平臺（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得補中益氣湯的活性成分及其作用靶點，從GeneCards數據庫收集與糖尿病腎病相關的靶標基因，將藥物作用靶點和疾病相關靶標基因取交集得到該方治療糖尿病腎病的關鍵作用靶點，使用String數據庫對關鍵作用靶點構建蛋白質相互作用網絡，并通過Cytoscape軟件將結果可視化。借助DAVID和ClueGo對關鍵作用靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）分析和KEGG富集。結果：該方法找出了補中益氣湯182個活性成分和41個關鍵作用靶點其中DPP4，MAPK14，MAPK3，MAPK8，MMP2，MMP3，MPO，MTTP，NOS3等關鍵基因主要通過調控AGE-RAGE信號通路，Toll樣受體信號通路，cAMP信號通路，白細胞介素17（IL-17）信號通路，Relaxin信號通路，在細胞外泌體，細胞間隙，細胞核中發揮作用。結論：通過網絡藥理學預測補中益氣湯防治糖尿病腎病的關鍵靶點及其相關信號通路，推測該方劑對糖尿病腎病的潛在作用機制，可能主要參與抗炎、調節糖脂代謝及氧化應激等過程，為闡明補中益氣湯對糖尿病腎病的作用機制提供了科學依據。

關鍵詞：補中益氣湯;糖尿病腎病;網絡藥理學

中圖分類號：R285.5 ?文獻標識碼：A

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病較為常見的微血管并發癥之一，是終末期腎病的主要原因。中藥復方在治療糖尿病及其并發癥具有很大的潛力，并在臨床上也取得了很好的效果。補中益氣湯為中醫臨床常用經典方劑之一，記載于《內外傷辨惑論》，具有多年的臨床使用經驗，對防治糖尿病及其并發癥起到了很好的臨床療效。

網絡藥理學是中藥藥理的研究從“單個成分-單個靶點-單個疾病”向“多基因-多靶點-復雜疾病”的模式轉變。本研究采用網絡藥理學的方法，通過相關數據庫對補中益氣湯所含的活性成分進行篩選，并與疾病基因關聯得到關鍵作用靶點，對關鍵作用靶點進行生物信息學分析以求更為系統的了解補中益氣湯治療糖尿病腎病的機制，為進一步實驗驗證打下基礎。

1 材料及方法

1.1 活性成分作用靶點的獲取及收集

使用TCMSP平臺篩選出口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18的活性成分。通過TCMSP尋找活性成分的作用靶點，使用uniprot將活性成分的作用靶點的名稱導入，找出其與人類相關的基因并進行整理，得到活性成分作用靶點。利用Cytoscape軟件構建“活性成分-靶點”關系網絡。

1.2 糖尿病腎病疾病靶點的獲取及收集

GeneCards數據庫基本覆蓋了幾大數據庫對于基因的分析數據，是人類基因的綜合數據庫。GeneCards數據庫提供簡明的基因組，蛋白質組，轉錄，遺傳和功能上所有已知和預測的人類基因。使用GeneCards數據庫獲取與糖尿病腎病相關靶點基因。

1.3 關鍵靶點的獲取

將藥物活性成分作用靶點和疾病靶點基因取交集，獲得補中益氣湯治療糖尿病腎病的關鍵靶點。

1.4 關鍵靶點蛋白相關作用網絡的構建

String數據庫（https：//string-db.org/Version11.0）是用于預測的蛋白質-蛋白質相互作用的生物學數據庫，其數據來自眾多來源的信息，包括實驗數據，計算預測方法和公共文本集，可用于檢索蛋白/基因相互作用。將補中益氣湯處方治療糖尿病腎病的關鍵靶點導入String數據庫，將研究物種為選擇為人類，獲得蛋白互作關系，將結果以TSV格式導出。將所得數據導入Cytoscape軟件進行可視化，繪制蛋白相互作用網絡。節點大小與Degree值大小成正比。

1.5 關鍵靶點生物功能注釋及通路分析及可視化

DAVID（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）的網址是http：//david.abcc.ncifcrf.gov/。DAVID是一個生物信息數據庫，整合了生物學數據和分析工具，為大規模的基因或蛋白列表（成百上千個基因ID或者蛋白ID列表）提供系統綜合的生物功能注釋信息，幫助用戶從中提取生物學信息（GO分析和KEGG通路分析）。筆者將關鍵靶點基因輸入DAVID數據庫中進行GO富集分析，選擇生物過程（biological process），分子功能（molecular function），和細胞組成（cellular component）3個模塊。然后使用Cluego對關鍵靶點進行通路分析，選擇KEGG，設定P<0.05以確定關鍵靶點富集通路。Cluego利用kappa統計學建立的，反映了基于相關基因之間相似性的關系。

2 結果

2.1 “活性成分——靶點”網絡構建分析

將182個活性成分，774個靶點基因導入Cytoscape軟件進行網絡構建及可視化。其中按度值排名前20的有quercetin，PTGS2，CALM1，HSP90AB1，ESR1，NOS2，AR，PPARG，F10，PRSS1，PAL_GLEAN10007028，kaempferol，NCOA2，ESR2，SCN5A，GSK3B，CDK2，PTGS1，CCNA2，MAPK14。

2.2 補中益氣湯治療糖尿病腎病的關鍵靶點收集

通過GeneCards平臺收集糖尿病腎病相關靶點基因，與活性成分作用靶點取交集后最終獲得41個關鍵靶點基因。關鍵靶點具體為：ACHE、ADIPOQ、ADRB1、APOB、BCL2、CREB1、CRP、CYP19A1、DPP4、DRD1、E2F1、EGF、ESR1、GSK3B、HAS2、HIF1A、HMGCR、HSPA5、HTR2A、IGF2、IL1B、JUN、MAPK1、MAPK14、MAPK3、MAPK8、MMP2、MMP3、MPO、MTTP、NOS3、PLAT、PLAU、PPARD、PTGS1、SELE、SIRT1、SPP1、STAT3、THBD、VCAM1。

2.3 關鍵靶點基因蛋白質相互作用網絡分析

將關鍵靶點導入String數據庫，將研究物種為選擇為人類，將minimum required interaction score設置為大于0.9，獲得蛋白基因互作關系。將結果TSV格式導出，再將所得數據導入Cytoscape軟件進行可視化，繪制蛋白相互作用網絡，其中度值越大，節點越大，度值排名前八的有STAT3，JUN，MAPK3，MAPK1，ESR1，CREB1，MAPK14，MAPK8，表明這些靶點在補中益氣湯治療糖尿病腎病中有著重大的作用。

2.4 關鍵靶點的GO分析

對關鍵靶點基因進行GO富集分析，根據FDR篩選得到22個條目（FDR<0.05），網絡中的關鍵靶點通過激活細胞轉錄因子，調節細胞生物信號轉導，調控葡萄糖代謝，血管生成，MAP激酶活性，脂多糖介導的信號通路等路徑，在細胞外泌體，細胞間隙，細胞核中發揮作用。

2.5 KEGG通路分析

筆者采用Cytoscape中的插件ClueGO來對關鍵靶點進行通路富集分析。關鍵靶點主要集中在AGE-RAGE信號通路、Toll樣受體信號通路、環磷酸腺苷（cAMP）信號通路、白細胞介素17（IL-17）信號通路、松弛素（Relaxin）信號通路。這些途徑在氧化應激、炎癥、腎纖維化等方面具有良好的作用。

綜上所述，通過網絡藥理學預測補中益氣湯防治糖尿病腎病的關鍵靶點及其相關信號通路，推測該方劑對糖尿病腎病的潛在作用機制，可能主要參與抗炎、調節糖脂代謝及氧化應激等過程，為闡明補中益氣湯對糖尿病腎病的作用機制提供了科學依據。但本研究還存在一些缺陷，主要是未對預測獲得的活性成分、關鍵靶點和有關通路進行實驗驗證。為了進一步深入探討其復雜的過程和作用機制，本課題將會結合上述結果進行更深一步的實驗研究。

參考文獻：

[1]俞孝芳，李紅.雌激素與糖尿病腎病[J].國外醫學.內分泌學分冊，2005（04）：265-267.

[2]馬素珍，石寧，劉丹丹，馮黎，楊少文，朱艷琴.人CREB1基因及蛋白的生物信息學分析[J].生物技術，2016，26（06）：557-573.

基金項目：國家自然科學基金（81073111，81374029，81874359）;江蘇省自然科學基金（BK20161371）;江蘇省高校自然基金（18KJB36011）

作者簡介：陳璟（1987-），男，漢族，在讀博士研究生，講師，研究方向：中藥藥理與中藥藥劑。

*通訊作者：呂志陽（1983-），男，漢族，黑龍江人，博士，講師，主要從事藥物新型給藥系統和適應性研究。