陜西榆林地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性分子鑒定

付 博，王家哲，任 平，李英梅，張 鋒

(1. 陜西省生物農業研究所 陜西省植物線蟲學重點實驗室，陜西 西安 710043；2. 陜西省酶工程技術研究中心，陜西 西安 710600)

2015年1月，我國農業部提出了馬鈴薯主糧化發展戰略，力爭通過擴大種植面積、提效增產，使馬鈴薯成為我國的第四大主糧作物[1,2]。陜西北部(包括榆林和延安)地處黃土高原，馬鈴薯是當地主要糧食作物和經濟作物，是近年來當地農民增收和精準扶貧的首選優勢產業，僅2017年陜北地區的馬鈴薯種植面積就達到了23.1萬hm2，占全省馬鈴薯總面積的60%[3]。馬鈴薯腐爛線蟲(Ditylenchus destructor)是危害馬鈴薯塊莖的重要檢疫性有害生物，一般可造成馬鈴薯減產20%～50%，嚴重時可達100%，嚴重影響了馬鈴薯的產業發展[4～6]。該病害在其他國家和地區也均有發生，并可在甘薯上引起嚴重病害，一般引起甘薯田塊減產30%～50%，嚴重時絕產絕收[7]。目前，我國對馬鈴薯腐爛莖線蟲危害的相關研究報道較少，對榆林地區馬鈴薯線蟲病害的研究尚未見報道。

馬鈴薯腐爛莖線蟲的鑒定方法，主要包括形態學分析(鏡檢形態觀察和數據測量)和分子生物學檢測(對rRNA-ITS區序列進行比對分析)[8]。由于線蟲形態具有復雜和重疊交錯的特點，在種水平和生物型上很難區分，因此分子診斷逐漸成為植物線蟲研究的新途徑[9, 10]。近年來，國內外的研究報道顯示馬鈴薯腐爛莖線蟲存在種群分化現象，Subbotin等人對全球范圍內已報道的78個馬鈴薯腐爛莖線蟲的rRNA-ITS區序列和28S rRNA-D2/D3區序列進行聚類，結果顯示基因序列和長度在不同群體間存在明顯差異，并將馬鈴薯腐爛莖線蟲劃分為7個生物型，主要為A型和B-G型兩個分支，除G型外，其他6種生物型在中國都有分布，表明馬鈴薯腐爛莖線蟲在我國的分布具有遺傳多樣性豐富的特征[11]。王金成等通過對馬鈴薯腐爛莖線蟲7個地理群體的ITS序列分析，證明了我國的馬鈴薯腐爛莖線蟲種群主要分為A型和B型2個分支[12]。

隨著馬鈴薯產業的不斷發展擴大，線蟲為害風險也日漸增加，明確馬鈴薯線蟲病的發生情況和線蟲種群類型，對有效防控該病害具有重要意義。筆者研究采用特異性分子生物學檢測方法，對陜西榆林地區的馬鈴薯腐爛莖線蟲進行種類鑒定，明確該地區線蟲病害的種類并分析群體系統發育關系，為馬鈴薯腐爛莖線蟲病的快速診斷和及時防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲源 馬鈴薯采集自陜西榆林地區8個不同采樣點，選取外表有腐爛癥狀，表皮皺縮、龜裂的薯塊并置于4 ℃冰箱保存。將病薯切成小塊浸泡于適量水中，兩層面巾紙過濾12 h后收集病原線蟲[13]。馬鈴薯的采集時間、地點見表1。

1.1.2 主要試劑及儀器 Taq PCR Master Mix(Cat. No.：B639295)、DNA marker 2000 (Cat. No.：B600335)購自上海生工。PCR儀(eppendorf Mastercycler gradient)、冷凍離心機(Sigma 1-14K)、電泳儀(Baygene BG-Power 600)、紫外分析儀(ChampGel 5000)、顯微鏡(奧林巴斯BX-41)等。

1.1.3 引物序列 馬鈴薯腐爛莖線蟲PCR擴增的通用引物和特異性引物均由西安擎科澤生物技術有限公司合成，序列見表2。

表1 馬鈴薯采集信息

表2 PCR擴增引物

1.2 方法

1.2.1 馬鈴薯腐爛莖線蟲DNA提取 取1滴線蟲溶液至潔凈的凹玻片，體視顯微鏡下并挑取待測線蟲(每個檢測樣品100頭蟲)，放入至含有14 μL 10×Extaq Buffer，蛋白酶K(2 mg·mL-1)6 μL，ddH2O 20 μL的PCR管中，于-80 ℃冰箱冷凍保藏2 h，玻璃棒研磨2次以上。PCR運行程序：65 ℃ 90 min，85 ℃10 min，13 000 r·min-1離心1 min取上清即為馬鈴薯腐爛莖線蟲基因組DNA[15]。

1.2.2 分子生物學鑒定 反應體系 Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各1.5μL，模板DNA 3 μL，ddH2O 6.5 μL。PCR擴增條件： 95 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35個循環，最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存[15]。取2 μL擴增產物在0.8%瓊脂糖凝膠上電泳，設置120 v 20 min，在凝膠成像儀中觀察并照相。

1.2.3 測序及序列分析 將PCR產物送西安擎科澤生物技術有限公司進行測序，將獲得的8個種群序列與GenBank中下載的7個國內外種群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列進行ClustalX比對分析，采用UPGMA法構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 通用引物擴增馬鈴薯腐爛莖線蟲rDNA-ITS序列的結果

分別以陜西榆林8個地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的總DNA為模板，采用通用引物rDAN1/ rDAN2擴增rDNA-ITS序列，結果顯示8個地區種群的樣本均擴增出1100 bp的條帶，無940 bp的條帶(圖1)，判斷這8個地區的馬鈴薯線蟲病害是由B型馬鈴薯腐爛莖線蟲引起[15]。

2.2 特異性引物鑒定馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型

采用特異性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2分別進行PCR，結果顯示擴增出485 bp條帶，無252 bp條帶(圖2)。采用特異性引物對陜西8個地區的馬鈴薯腐爛莖線蟲進行分型鑒定，結果均為B型，與上述通用引物PCR擴增鑒定的結果一致。

2.3 馬鈴薯莖線蟲rDNA-ITS序列分析

特異性引物PCR擴增產物的測序結果顯示，序列1～8與馬鈴薯腐爛莖線蟲的同源性均達到99%以上。將榆林地區8個種群的特異性引物擴增序列與GenBank中7個國內外馬鈴薯腐爛莖線蟲種群(EF062575、AM232227、AY987007、EF062572、FJ911551、KC923223、EF062574)的rDNA-ITS序列進行ClustalX比對分析并構建系統發育樹。結果顯示，在親緣關系上所有的序列聚為3個分支，獲得的榆林地區8個種群中，1、2、3、4、5、8和EF062575、AM232227群體聚為一個分支，6和KC923223、EF062574群體聚為一個分支，7和EF062572、AY987007、FJ911551群體聚為一個分支，榆林地區8個地理種群的馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較高的親緣關系。

3 討論

自2012年以來筆者研究團隊在陜西省植保總站的大力支持下，從陜西省榆林地區的馬鈴薯上發現疑似馬鈴薯腐爛莖線蟲病害，并連續多年對陜西榆林、延安等地區的馬鈴薯檢疫性病蟲害進行了田間調查，完成了馬鈴薯腐爛莖線蟲的人工培育、形態觀察和分子鑒定、生態適應性分析等一系列工作[16]。近年來，陜西榆林地區的馬鈴薯產業發展迅速，但是線蟲為害風險也日漸增加，為進一步明確線蟲種類，實現快速診斷和有效防控，筆者研究采用特異性引物DdS1/DdS2和DdL1/DdL2進行線蟲分子鑒定。研究結果表明，陜西省榆林8個地區的馬鈴薯線蟲病害的病原線蟲是馬鈴薯腐爛莖線蟲，其生物型為B型。rDNA-ITS序列進行比對和系統發育樹分析顯示，這8個地區的馬鈴薯腐爛莖線蟲具有較高的親緣關系。

王金成等通過DNA-ITS序列分析和系統發育研究證明了我國腐爛莖線蟲是1個復合種群體，明確了河北、江蘇、山西、山東、安徽5個省份的甘薯上的馬鈴薯腐爛莖線蟲包含A型和B型2種[12]。李惠霞等研究了甘肅省定西市馬鈴薯線蟲病的病原種群分類地位，并根據形態學特征及rDNA-ITS序列分析確定該病原線蟲為馬鈴薯腐爛莖線蟲，并發現其存在B型和C型2個不同的生物型[2]。目前，我國馬鈴薯腐爛莖線蟲存在較為嚴重的群體分化現象，包括了A～F 6種不同類型[11, 17]，筆者研究中鑒定的陜西榆林地區為B型馬鈴薯腐爛莖線蟲。根據文獻報道我國不同地區腐爛莖線蟲群體的差異明顯，說明其正處于快速進化過程，并且不同地理來源的腐爛莖線蟲在抗藥性、致病力、蟲體大小等方面也存在差異[18～20]。

筆者研究明確了陜西榆林馬鈴薯腐爛莖線蟲的生物型，證明了特異性引物適用于快速鑒定腐爛莖線蟲A型和B型群體，為腐爛莖線蟲種群的分類學、群體遺傳學研究， 以及有針對性開展病害防治提供理論指導。