絨山羊環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的鑒別診斷分析

仇薪鑫，牛華鋒，賈燕青，張振倉

(楊凌職業技術學院 動物工程分院，陜西 楊凌 712100)

泰勒焦蟲病史嚴重危害畜牧業的寄生蟲病，其病原較多，主要包括環形泰勒蟲(T. annulata)和瑟氏泰勒蟲(T. sergenti)[1]。獸醫臨床常用血涂片進行染色鏡檢，雖然該方法簡便易行，但是十分依賴鑒定工作者的臨床經驗，而且可能產生鑒定錯誤，檢出率較低，影響治療。為了對羊泰勒蟲病的病原進行快速準確鑒定，筆者研究在形態學鑒定的基礎上，結合分子生物學方法，根據T. annulata 30 KDa基因和T. sergent MPSP表面蛋白基因序列分別設計各自的上下游引物，進行擴增和序列分析。筆者研究對環形泰勒蟲和色泰勒蟲具有較高的敏感性和特異性，實際診斷中還能夠對不同的病原做出快速鑒定，為準確的針對性治療提供參考。

1 試驗材料

1.1 研究對象

發生泰勒焦蟲病的絨山羊血液樣品，環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲陽性標準品(由甘肅省農業大學動物醫學院贈送)。

1.2 試劑材料

試劑：DNA提取試劑盒，GenStar公司產品，姬姆薩染色液，10xBuffer緩沖液，四種dNTP底物，4 mmol·L-1MgCl2，Tag DNA聚合酶，雙蒸水，溴化乙錠，瓊脂糖等，引物由上海生工合成。

2 試驗方法

2.1 血液涂片的制作和染色

絨山羊頸靜脈采血，加入枸櫞酸鈉抗凝，-20℃保存備用。取一滴抗凝血于載玻片，另一個載玻片從側面推片制備血圖片，自然干燥，甲醇固定5 min，然后經吉姆薩染色，水洗，鏡檢。

2.2 羊泰勒蟲PCR檢測方法的建立

2.2.1 引物的設計與合成 根據GenBank登錄的環形泰勒蟲30 kDa和瑟氏泰勒蟲MPSP表面蛋白序列為模板設計引物，送上海生工合成。引物序列如下：環形泰勒蟲(T. Annulata) 30 KDa 上游引物 5’-GTAACCTTTAAAAACGT-3’;下游引物 5’-GTTACGAACATGGGTTT-3’，瑟氏泰勒蟲(T. sergenti)MPSP 上游引物5’-CACAGCTATGTTGTCCAAGAG-3’；下游引物 5’-TGTGAGACTCAATGCGCCTA-3’預計擴增片段長度分別為200 bp和830 bp。

2.2.2 PCR反應及鑒定 環形泰勒蟲30kDa基因和瑟氏泰勒蟲MPSP PCR擴增體系(20 μL)：模板，1 μL；上下游引物(10 pmol·L-1)各1 μL，2×Genestar Mix，10 μL；ddH2O, 7Μl。預設擴增參數為：94℃ 5 min；然后94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，進行35個循環；最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物，1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.3 最適退火溫度的篩選 將環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標準DNA樣品按照10-6稀釋，取1μL為模板進行梯度PCR擴增，退火的梯度范圍為51～59℃，確定最佳退火溫度。

2.2.4 敏感性試驗 將環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標準DNA樣品按照10-2稀釋，按照2.2.2 PCR方法進行PCR擴增，確定合適PCR反應的敏感性。

2.2.5 引物特異性試驗 利用設計的特異性引物分別以不同的DNA陽性樣品(環形泰勒蟲、瑟氏泰勒蟲、呂氏泰勒蟲)為模板進行特異性試驗分析。

2.3 序列比對分析

將PCR進行優化，以發生血液泰勒蟲病絨山羊的血液DNA為模板，獲取的產物進行測序和比對分析。

3 試驗結果

3.1 血涂片結果

在羊血液焦蟲病流行地區，采集臨床癥狀為貧血、黃疸的羊抗凝血樣本，并做血涂片。經姬姆薩染色，鏡檢(鏡檢 1 000×)，可見羊紅細胞內羊泰勒蟲輪廓和其原生質呈淺藍色。

3.2 PCR擴增體系的預擴增

用設計的環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的特異性引物，在上述PCR擴增體系和預設的反應參數，對環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲DNA標準模板1μL進行預擴增。結果試驗設計的的特異性引物能擴增出的片段大小分別為193 bp和875 bp。

M.Marker2000:1.環形泰勒蟲PCR擴增產物

2.陰性對照

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒蟲PCR擴增產物

2.陰性對照

3.3 PCR反應參數中退火溫度的確定

對環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標準品DNA進行1×106稀釋，進行梯度PCR擴增。從圖4和圖5可以看出，隨著退火溫度的變化產物的量也在變化。

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

M.Marker2000:1.51℃;2.52℃;3.53℃;4.55℃;5.55℃;6.56℃;7.57℃;8.58℃;9.59℃;

對于環形泰勒蟲，退火溫度在54.0～57.0℃之間時特異性擴增帶的亮度高，在56℃時最高。對于瑟氏泰勒蟲，退火溫度在53.0～57.0℃之間時特異性擴增帶的亮度高，在55℃時最高。

退火溫度太高或者太低都會影響擴增產物的量。因此以56℃和55℃分別作為環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲反應參數中的最適退火溫度。

3.4 引物特異性試驗

環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲引物分別只能夠擴增對應的產物。

M.Marker2000:1.環形泰勒蟲;2.瑟氏泰勒蟲 3呂氏形泰勒蟲

M.Marker2000:1.瑟氏泰勒蟲;2.環形泰勒蟲 3.呂氏形泰勒蟲

3.5 敏感性試驗

經紫外分光光度計測定環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲標準DNA含量分別為150 mg·L-1和170 mg·L-1。反應體系中檢測標準模板DNA的最大稀釋倍數為1x109，則環形泰勒蟲標準模板最低檢測量為0.15 fg，瑟氏泰勒蟲標準模板最低檢測量為0.17 fg。

M.Marker2000:1.1x101稀釋;2.1x103稀釋;

2.1x105稀釋;2.4x107稀釋;5.1x109稀釋;6.1x1011稀釋

M.Marker2000:1.1x101稀釋;2.1x103稀釋;

2.1x105稀釋;2.4x107稀釋;5.1x109稀釋;6.1x1011稀釋

3.6 序列比對分析

分別以環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲基因組DNA為模板，利用設計的各自特異性引物在最佳反應條件下(環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的退火溫度分別為56℃和55℃)進行PCR能夠得到的特異性片段長度分別為193 bp和875 bp。將擴增片段測序，序列分析表明與GenBank中的環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲同源性為100%。

4 討論

筆者研究通過血液涂片染色方法和PCR檢測方法對采集的兩份疑似感染泰勒蟲病的羊血液樣品進行檢測，得出以下結論。血涂片染色鏡檢可見羊紅細胞內蟲體大小約為0.5～1.5μm，原生質呈淺藍色，染色質呈紅色，蟲體呈梨籽形、環形、橢圓形、短桿形、圓點形等多形態，初步鑒定為該蟲體為泰勒蟲。以環形泰勒蟲的30 KDa表面蛋白基因序列和瑟氏泰勒蟲MPSP表面蛋白基因序列分別建立各自特異性PCR檢驗方法。經檢測發現成功擴增出193 bp和875 bp目的片段。將擴增片段測序，序列分析表明與GenBank中注冊的環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲同源性為100%。敏感性試驗結果表明，建立的PCR檢測方法能夠檢測出環形和瑟氏的最低量分別為0.15 fg和0.17 fg。

環形泰勒蟲致病性較強,而瑟氏泰勒蟲具有分布范圍較廣的特點。兩種泰勒蟲常在野外發生混合感染，由于形態非常相似，傳統顯微鏡檢測不能很好區分它們，筆者試驗建立的絨山羊環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的診斷方法敏感性強、檢測效率高，可廣泛應用于兩種泰勒蟲的檢測，并為絨山羊環形泰勒蟲和瑟氏泰勒蟲的研究奠定了分子生物學基礎。