冷熏對高白鮭理化性質及肌球蛋白構象的影響

李 新，汪 蘭，石 柳，吳文錦，丁安子，熊光權

冷熏對高白鮭理化性質及肌球蛋白構象的影響

李 新，汪 蘭，石 柳，吳文錦，丁安子，熊光權※

（湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所/湖北省農業科技創新中心，武漢 430064）

以新疆塞里木湖高白鮭為研究對象，研究冷煙熏過程對魚肉理化性質及肌球蛋白構象的影響。冷熏溫度為（20±2）℃，發煙溫度140 ℃，冷熏時間分別為0、6、12、18、24 h，研究冷熏魚肉理化性質（含水率、水分活度、色澤、質構特性、TVB-N）及肌球蛋白構象（蛋白濃度、總巰基含量、Ca2+-ATPase、表面疏水性）變化。研究結果表明，冷熏0～24 h，魚肉含水率由75.75%下降至53.03%，水分活度（Aw）由0.988下降至0.952；魚肉亮度值（*）顯著降低（<0.05），紅度值（*）緩慢增加，黃度值（*）顯著增加（<0.05）；表征魚肉質構特性的剪切力與韌性均呈明顯上升趨勢（<0.05）；魚肉揮發性鹽基氮（TVB-N）由9.81上升至14.23 mg/100g；肌球蛋白濃度、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性均顯著降低（<0.05），表面疏水性增加（<0.05）；綜上，控制冷熏時間12~18 h有利于提高冷熏魚肉品質，降低魚肉肌球蛋白變性與氧化程度。該研究為特色淡水魚冷熏制品開發與煙熏過程中蛋白氧化調控提供理論依據與技術參考。

魚；理化性質；蛋白質；高白鮭；冷熏；肌球蛋白

0 引 言

高白鮭（），為鮭科、白鮭屬其中一種，是一種高好氧冷水性魚類[1]。1998年開始新疆從俄羅斯引種，經過多年繁育，高白鮭已具備產業化生產的規模[2]。高白鮭魚肉蛋白質、脂肪、必需氨基酸含量遠高于大宗魚類，是一種營養價值高可生鮮食用特色淡水魚[3]。目前高白鮭主要通過冷藏和冷凍2種方式儲運，高白鮭在冷藏溫度下貨架期非常短，而凍結解凍后魚肉質地軟爛，導致商品價值急劇降低，因此探尋和開發新型保鮮方法與加工制品具有重要的意義。

煙熏技術是一種肉類傳統的保藏方法。熏煙中主要包含酚類、醇類、羰基類化合物以及有機酸、烴類等，這些化合物滲透至肌肉內部，賦予肉品特有的色澤和風味，另外熏煙中化合物具有抑菌和抗氧化作用，可以有效延長肉品貨架期[4-5]。冷熏技術在低于30℃條件下通過果木不完全燃燒產生的熏煙進行熏制，最大程度保留了肉品的營養價值與食用品質，是煙熏技術發展方向[6-7]。

肌肉蛋白在加工過程中受到溫度、光照、pH值、離子強度等因素影響發生改變，導致多肽鏈斷裂，氨基酸側鏈損傷，二級結構變化和形成大分子交聯聚合體等，主要表現在蛋白總羰基、巰基、各類二級結構改變[8]。肌球蛋白是肌肉中的主要蛋白，對肉制品質構、賦形、保水性和保留其他成分有重要意義。在肌肉加工過程中，不同的加工工藝參數都會引起肌球蛋白氧化變性，大部分研究主要集中于不同熱處理溫度對肌球蛋白性質的影響，而關于煙熏加工過程中肌球蛋白氧化變性規律鮮見報道[9]。本文以高白鮭為研究對象，重點研究冷熏時間對魚肉理化性質的影響，為開發高品質高白鮭煙熏制品提供技術參考；另外研究冷熏時間對魚肉肌球蛋白構象的影響，為探討冷熏工藝對蛋白質氧化變性影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

冷凍高白鮭由新疆賽湖漁業科技開發有限公司提供（捕撈后新鮮高白鮭，去鱗、去內臟、去腮，平均質量1 000 g/條，平均體長40 cm/條，-18℃凍藏15 d），于4 ℃條件下自然解凍。取脊背整塊肌肉部分，且去除魚皮。置于煙熏箱中進行熏制，箱溫設定20 ℃，溫差設定2 ℃，發煙參數140 ℃，木屑電機工作間歇時間10 s，熏制時間分別為0、6、12、18和24 h，熏制0 h即為空白對照組。

1.2 試驗試劑與儀器

BYXX-II煙熏箱，嘉興艾博實業有限公司；LabStart水分活度儀，瑞士NOVASINA公司；970CRT/XP熒光分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；TU-1810PC紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；CR-400色差儀，柯尼卡美能達（中國）投資有限公；TA-XTPlus質構儀，英國Stable Micro System公司；GL-25MS 高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；AL104分析天平、PL602-L分析天平，梅特勒-托利多上海有限公司。

五水硫酸銅、酒石酸鉀納、氫氧化鈉、氯化鉀、疊氮化鈉、Tris、鹽酸、硼酸、三氯乙酸、甲基紅、溴甲酚、-巰基乙醇、醋酸鎂、乙二醇雙四乙酸（EGTA）、三磷酸腺苷二納、碳酸氫鉀、氯化鎂、馬來酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、牛血清蛋白等均為AR級，采購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 含水率測定

參照食品安全國家標準《食品中水分的測定》[10]。

1.3.2 Aw測定

魚肉攪碎后均勻放入水分活度儀測定盒子中，測定溫度25 ℃，每組5份樣品，取平均值。

1.3.3 色澤測定

取魚肉內部肌肉樣，用濾紙吸附表面水分油脂，采用便攜式色差計測定*（亮度）、*（紅度）和*（黃度）值，以標準空白版校正，每組5份樣品，取平均值。

1.3.4 質構測定

魚肉分割切成2 cm×2 cm×2 cm大小相同的塊狀，采用質構儀 A/CKB 探頭下進行剪切力、韌性的測定，測前速率 5.0 mm/s，測中速率1.0 mm/s，測后速率5.0 mm/s，每組5份樣品，取平均值。

1.3.5 TVB-N測定

參照食品安全國家標準《食品中揮發性鹽基氮的測定》[11]。

1.3.6 肌球蛋白提取與濃度測定

溶液A：0.1mol/L KCl，0.02% NaN3，20 mmol/L Tris-HCl（pH值7.5）。

溶液B：0.45 mol/L KCl，5 mmol/L-巰基乙醇，0.2 mol/L醋酸鎂，1 mmol/L EGTA，20 mmol/L Tris-HCl（pH值6.8）。

溶液C：0.5 mol/L KCl，5 mmol/L-巰基乙醇，20 mmol/LTris-HCl（pH值7.5）。

攪碎后魚肉中加入預冷過的10倍體積的溶液A，并用高速分散均質機23 000 r/min均質1 min，5 ℃靜置15 min，4 000 r/min離心5 min，取沉淀加入5倍體積溶液B，攪拌制成懸浮液，同時緩緩加入ATP-Na2使肌球蛋白與肌動蛋白解離，ATP-Na2最終濃度為5 mmol/L，均質30 s使其混勻，5 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心10 min，上清液用5倍體積1 mmol/L KHCO3稀釋，5 ℃靜置2 h，10 000 r/min離心15 min，沉淀用2.5倍體積溶液C懸浮，5 ℃靜置10 min，用2.5倍體積1 mmol/L KHCO3稀釋并加MgCl2至終濃度為10 mmol/L，均質30 s使其混勻，5 ℃放置過夜，10 000 r/min離心25 min，沉淀為肌球蛋白，用20 mmol/L Tris-馬來酸緩沖液溶解備用。

采用雙縮脲法測定蛋白濃度，準確稱取0.5 g牛血清蛋白（BSA），用生理鹽水溶解后定容至100，即為溶度為5 mg/mL的標準蛋白質溶液。取6支25 mL具塞比色管，分別加入5 mg/mL標準蛋白溶液0.0、0.2 、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加蒸餾水至1.0 mL，加入雙縮脲試劑4 mL，用水稀釋至10 mL，搖勻，在室溫下放置30 min后，于560 nm處測定每管吸光值，然后以蛋白質濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標如圖1。

圖1 蛋白質標準曲線

1.3.7 總巰基含量測定

參照You 等[12]的方法并稍加修改。取1 mL肌球蛋白樣品溶液（0.4%），加入9 mL 0.2 mol/L Tris-HCl（其中含8 mol/L尿素，10 mmol/L EDTA，2%SDS，pH值7.0）緩沖液，混勻后在室溫下放置30 min，取4 mL，加入0.4 mL 0.1% DTNB（Tris-HCl，pH值為8.0）；在40 ℃反應25 min后，測定412 nm處的吸光值，以0.2M PBS為空白對照。計算公式如下

式中為總巰基摩爾濃度，mol/g；0為蛋白質濃度，mg/mL；為412 nm 處的吸光值；為稀釋倍數；為摩爾消光系數，13 600 L/(mol·cm)。

1.3.8 Ca2+-ATPase測定

根據Wang 等[13]方法并稍加修改。將肌球蛋白濃度調節至4 mg/mL，在離心管中依次加入0.20 mL 0.50 mol/L Tris-馬來酸（pH值為7.0）、0.20 mL 0.10 mol/L CaCl2，0.40 mL肌球蛋白溶液，3.00 mLH2O，置于25 ℃的水浴中，最后加入0.20 mL20 mmol/L ATP（pH值為7.0），反應開始。在反應進行3 min后，加入2 mL15%TCA停止反應，10 000 g離心2 min，取上清液備用?？瞻紫燃尤隩CA，后加入ATP。取上述離心液4 mL加入3 mL Tris-MgCl2緩沖液（pH值為7.5），混合均勻加入3 mL定磷試劑（20%抗壞血酸：3 mol/L H2SO4：3%鉬酸胺等體積混合），在45 ℃恒溫水浴發色30 min，在640 nm測定吸光度。ATPase活性的表示方法為1 mg蛋白在1 min內生成的無機磷酸量。

1.3.9 表面疏水性測定

參照You 等[12]方法。用雙縮脲法測定蛋白濃度，采用緩沖溶液（0.6 mol KCl-20 mmol Tris-馬來酸，pH值為7.0）稀釋至濃度分別為0.1、0.2、0.3和0.5 mg/mL濃度的蛋白溶液。分別取上述蛋白溶液2 mL加10L ANS溶液（8 mmol/L，溶解在0.1 mol/L pH值為7.0 PBS溶液中）。混勻后采用熒光光譜儀測定，操作條件為：激發波長為385 nm，掃描范圍400～700 nm，掃描速度500 nm/min，激發狹縫和發射狹縫寬均為3 nm，響應時間為0.1 s，記錄470 nm波長處的熒光發射強度FI′，并測定不加ANS的蛋白溶液熒光強度（FI0），FI′與FI0的差值記為FI，以蛋白濃度為橫坐標，FI為縱坐標作圖，曲線初始段的斜率即為蛋白質分子的表面疏水性指數0。

1.4 數據處理

試驗所得數據均用平均值±標準偏差表示，采用SAS分析軟件檢驗組間差異顯著性（<0.05）。

2 結果與討論

2.1 冷熏對魚肉含水率與水分活度的影響

表1表示不同冷熏時間魚肉含水率與水分活度，結果表明，新鮮魚肉含水率較高，達到75.75%，冷熏過程中，魚肉含水率不斷下降，其中冷熏18 h，魚肉含水率顯著降低（<0.05），冷熏18～24 h，魚肉含水率無顯著性變化。魚肉水分活度隨冷熏時間延長而降低（<0.05）。冷熏魚肉水分活度與含水率呈正相關，即水分活度隨含水率降低而降低，然而冷熏過程中魚肉水分活度均高于0.950，由此可以推斷，水分活度對于冷熏魚肉貨架期的延長不是主要因素。

表1 不同冷熏時間魚肉含水率與水分活度（n=5）

注：不同字母表示差異顯著(<0.05)，下同。

Note: Different letters indicate significant difference at 0.05 level, the same as following.

2.2 冷熏對魚肉色澤的影響

表2結果表明，新鮮魚肉亮度值（*）、紅度值（*）、黃度值（*）分別為58.64、?0.80、3.00，呈現一種亮白色，隨著冷熏時間延長，魚肉亮度值顯著降低（<0.05），紅度值呈緩慢增加趨勢，黃度值顯著增加（<0.05），熏制24 h，魚肉呈現一種黃褐色。熏制過程中，熏煙中酚類、醛酮類、酸類等有機化合物附著滲透作用使魚肉色澤發生改變。另外，魚肉色澤指標變化與肌肉中含水率與分布改變存在相關性[14-15]。魚肉色澤褐變與肌紅蛋白氧化與脂肪氧化有關，還原型肌紅蛋白氧化生成高鐵肌紅蛋白，而脂肪氧化產生的自由基破壞魚肉中色素，2者之間具有相互促進作用，使魚肉色澤向褐色轉變[16]。因此魚肉在冷熏過程中色澤的改變是基于熏煙的附著滲透、含水率與分布狀態改變以及肌紅蛋白與脂肪氧化的綜合效應。

表2 色澤隨冷熏時間變化（n=5）

2.3 冷熏對魚肉質構特性的影響

魚肉剪切力、韌性指標關系到肌肉組織嫩度和粗糙度，反應肌肉內部組織的緊密程度。冷熏過程中魚肉剪切力、韌性變化見圖2，由圖2所示，隨著冷熏時間延長，魚肉剪切力呈線性平緩增加趨勢，冷熏18 h，魚肉韌性緩慢增加，18 h以后，魚肉韌性顯著增加。魚肉剪切力、韌性增加與煙熏期間魚肉含水率降低有關，另外肌肉蛋白氧化形成蛋白聚合物也會使魚肉質構特性發生改變[17-19]。

圖2 剪切力、韌性隨冷熏時間變化（n=5）

2.4 冷熏對魚肉TVB-N的影響

揮發性鹽基氮（TVB-N）是水產品新鮮度評價的重要理化指標，反映內源性酶和微生物的作用分解蛋白質及其非蛋白類物質產生的具有揮發性的氨、二甲胺和三甲胺等的程度[20]。由圖3所示，新鮮魚肉TVB-N為9.81 mg/100 g，隨著冷熏時間延長，TVB-N緩慢增加，冷熏24 h，魚肉TVB-N為14.23 mg/100 g，符合食品安全國家標準鮮、凍動物性水產品（GB 2733-2015）規定的淡水魚TVB-N≤20 mg/100 g[21]。由此可以推斷，冷熏過程保持熏制低溫環境，熏煙中化合物可以有效抑制微生物生長，減少揮發性氨類物質產生，從而有效保持魚肉新鮮度。

圖3 TVB-N隨冷熏時間變化（n=5）

2.5 冷熏對魚肉肌球蛋白濃度的影響

魚肉中蛋白質根據溶解性大致分為水溶性蛋白、鹽溶性蛋白和不溶性蛋白，肌球蛋白是鹽溶性蛋白，是各類肌細胞中含量最多的結構蛋白和收縮蛋白，是構成肌肉肌原纖維基本組成蛋白[22]。如圖4所示，冷熏過程中魚肉肌球蛋白濃度隨冷熏時間延長顯著降低（<0.05），新鮮高白鮭魚肉肌球蛋白含量為9.44 mg/g，冷熏24 h后肌球蛋白含量為1.81 mg/g，下降了80.8%。冷熏期間，熏煙中的有機醇、醛、酸類化合物不斷地滲入肌肉組織中，導致肌球蛋白變性使其溶解性降低，從而使蛋白濃度降低。

圖4 肌球蛋白濃度隨冷熏時間變化（n=5）

2.6 冷熏對魚肉肌球蛋白總巰基含量的影響

疏基是蛋白質重要的功能基團，具有較高的抗氧化性，容易被氧化形成含硫化合物如-SOH、-SOOH、-SS-，使總巰基含量減少[23]。另外二硫鍵與其他化合鍵發生交聯，是形成蛋白質聚合的主要途徑[24-25]。如圖5結果所示，新鮮魚肉肌球蛋白總巰基含量為3.34 mol/105g蛋白，冷熏過程中，總巰基含量不斷降低，冷熏24 h總巰基含量減少至0.657 mol/105g蛋白。總巰基含量持續降低表明冷熏過程中肌球蛋白發生不可逆氧化變性，其值越低表征蛋白變性程度越高。

圖5 總巰基含量隨冷熏時間變化（n=5）

2.7 冷熏對魚肉肌球蛋白Ca2+-ATPase活性的影響

Ca2+-ATPase活性表征肌球蛋白頭部完整性的指標，Ca2+-ATPase活性下降與肌球蛋白頭部的巰基發生氧化以及蛋白質交聯有關[26]。如圖6所示，冷煙熏條件下肌球蛋白的Ca2+-ATPase活性隨煙熏時間的延長而降低。新鮮魚肉冷熏24 h，Ca2+-ATPase活性由1.985mol/(mg·h)下降至0.244mol/(mg·h)，其中冷熏0～12 h，Ca2+-ATPase活性顯著降低（<0.05），冷熏12～24 h，Ca2+-ATPase活性變化不明顯（>0.05）。

圖6 Ca2+-ATPase活性隨冷熏時間變化（n=5）

2.8 冷熏對魚肉肌球蛋白表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性反應蛋白質分子內部疏水基團的暴露程度[27]。圖7結果表明，冷熏6 h，肌球蛋白表面疏水性增加（>0.05），冷熏6～18 h，肌球蛋白表面疏水性變化不明顯（>0.05），冷熏24 h，肌球蛋白表面疏水性上升（<0.05）。冷熏過程中肌球蛋白表面疏水性增加與巰基含量減少呈對應關系，與巰基氧化生成二硫鍵形成蛋白聚合物相關[28-29]。

圖7 表面疏水性隨冷熏時間變化（n=5）

3 結 論

相比熱熏而言，冷熏是一種輕度的熏制方法，冷熏溫度保持在（20±2）℃左右，避免腐敗微生物快速生長繁殖，另外熏煙中含有的羰基、酚類、有機酸、醇類等化合物可以有效地抑制微生物生長，因此冷熏可以較好地保持魚肉品質。隨著冷熏時間延長，魚肉含水率、水分活度呈下降趨勢，冷熏24 h，魚肉含水率53.03%，水分活度0.952，因此冷熏魚肉仍大部分保留新鮮魚肉的組織形態；冷熏過程中，魚肉亮度下降，紅度緩慢增加，而黃度顯著增加，魚肉色澤由白色向褐色轉變；魚肉剪切力、韌性呈上升趨勢，表明熏制魚肉嫩度下降，咬合力增加；魚肉TVB-N緩慢增加，冷熏24 h，TVB-N<15 mg/100 g，冷熏期間低溫控制可以較好地保持魚肉新鮮度；魚肉肌球蛋白濃度、總巰基含量、Ca2+-ATPase活性逐漸降低，表面疏水性增加，肌球蛋白在冷熏過程中發生氧化變性。綜合高白鮭魚肉冷熏過程中感官品質、新鮮度、肌球蛋白性質變化趨勢，控制魚肉冷熏時間12～18 h可以有效地保障冷熏魚肉品質特性。

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Effects of cold smoking on physicochemical properties and myosin conformations of

Li Xin, Wang Lan, Shi Liu, Wu Wenjin, Ding Anzi, Xiong Guangquan※

(430064,)

The effect of cold smoking treatment on the physicochemical properties and myosin conformations offrom Sayram Lake (Xinjiang, China) were studied. The parameters of cold smoking machine were set as (20±2)℃ of environment temperature and 140 ℃ of smoke temperature, respectively. Pre-treatedwas subjected to different cold smoking duration (0, 6, 12, 18 and 24 h, respectively), and then the changes of its physicochemical properties (moisture content, water activity (), color, texture and TVB-N content) were investigated; then myosin was extracted from treated fish muscle, and its conformation change (myosin content, total sulfhydryl content, Ca2+-ATPase activity and surface hydrophobicity) was studied as well. During the 24 h of cold smoking treatment, the moisture content of fish muscle was significantly decreased from 75.75% to 53.03% (<0.05), and thewas significantly decreased from 0.988 to 0.952. The value of lightness (*), redness (*) and yellowness (*) of fresh fish flesh was 58.64, -0.80 and 3.00, respectively. With the extension of smoking time,*was significantly decreased (<0.05),* was slowly increased (<0.05) and* was significantly increased (<0.05), and finally thecolor of fish flesh was transferred from gloss white to yellowish-brown. Both the shear force and toughness of fish meat subjected to cold smoking treatment were obviously increased (<0.05) with the prolongation of smoking time. Meanwhile, the TVB-N content of fish product was gradually increased from 9.81 to 14.43 mg/100 g after the cold smoking treatment (24 h), which met the country’s national safety standards.On the other hand, the content of extracted myosin frommuscle was significantly decreased (<0.05) with the extension of smoking time, along with the decrease (<0.05) of total sulfhydryl content and Ca2+-ATPase activity. The surface hydrophobicity of extracted myosin was continually increased during smokingtreatment (<0.05). The results suggested that cold smoking treatment could lead to the protein denaturation of fish, and the degree of protein denaturation was getting severer when the treated time was longer. Therefore, comprehensively considering the results of sensory evaluation, freshness, protein denaturation of cold-smokedand economic cost and production period of fish processing, 12 h of cold smoking treatment could effectively obtain the superior quality of cold smokedThis paper could provide a theoretical basis and technical guidance for the development of cold smoked special freshwater products and for the control of the protein oxidation of fish product during cold smoking processing.

fish; physicochemical properties; protein;; cold smoking; myosin

李新，汪蘭，石柳，等. 冷熏對高白鮭理化性質及肌球蛋白構象的影響[J]. 農業工程學報，2020，36(8)：254-259.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.08.031 http://www.tcsae.org

Li Xin, Wang Lan, Shi Liu, et al. Effects of cold smoking on physicochemical properties and myosin conformations of[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(8): 254-259. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.08.031 http://www.tcsae.org

2019-10-22

2020-04-09

現代農業產業技術體系專項資金資助（CARS-46）

李新，副研究員，研究方向為水產品保鮮加工。Email：leexin117@163.com

熊光權，研究員，研究方面為水產品保鮮與貯運。Email：351609901@qq.com

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.08.031

TS254.4

A

1002-6819(2020)-08-0254-06