凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-串聯質譜法測定輻照肉制品中2-十二烷基環丁酮

邵彪　周小蘭　王琳琳　尤嘉　陳剛

摘 要：基于凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）凈化處理，建立輻照肉制品中2-十二烷基環丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB）的氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）檢測方法。樣品經正己烷超聲提取、GPC凈化及氮吹濃縮等步驟處理后，利用GC-MS/MS多反應監測模式進行分析。結果表明：2-DCB在質量濃度10～1 000 μg/L范圍內線性良好，線性方程為y=383 709.18x-4 686.41，相關系數為0.998 3;25、100、400 μg/kg 3 個加標水平的平均回收率為78.2%～105.5%，相對標準偏差小于7.3%;檢出限和定量限分別為1.8、6.0 μg/kg。該方法前處理操作簡單、可實現自動化批量處理，同時具有較高靈敏度。

關鍵詞：凝膠滲透色譜;輻照肉制品;氣相色譜-串聯質譜;2-十二烷基環丁酮

Detection of 2-Dodecylcyclobutanone in Irradiated Meat Products by Gel Permeation Chromatography

Followed by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

SHAO Biao1， ZHOU Xiaolan2， WANG Linlin1， YOU Jia3， CHEN Gang1，*

（1.Nantong Products Quality Supervision and Inspection Institute， Nantong 226011， China; 2.Nantong University Analysis and Testing Center， Nantong 226019， China; 3.Nantong Food and Drug Supervision and Inspection Center， Nantong 226006， China）

Abstract： Based on clean-up by gel permeation chromatography （GPC）， a method for the determination of 2-dodecylcyclobutanone （2-DCB） in irradiated meat products by gas chromatography-tandem mass spectrometry

（GC-MS/MS） was established. Samples were subjected to sequential ultrasonic extraction with n-hexane， purification by GPC， concentration and nitrogen blowing evaporation to dryness before being analyzed by GC-MS/MS. The results showed that a linear calibration curve in the concentration range of 10–1 000 μg/L was obtained as follows y = 383 709.18x ? 4 686.41， with correlation coefficient of 0.998 3. The average recoveries of 2-DCB at three spiked concentration levels of 25， 100

and 400 μg/kg ranged from 78.2% to 105.5%， with relative standard deviation （RSD） lower than 7.3%. The detection limit and quantitation limit were 1.8 and 6.0 μg/kg， respectively. The method had the advantages of simple pretreatment， large-scale automated detection and high sensitivity.

Keywords： gel permeation chromatography; irradiated meat products; gas chromatography-tandem mass spectrometry; 2-dodecylcyclobutanone

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040

中圖分類號：O657.6 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2020）04-0053-05

引文格式：

邵彪， 周小蘭， 王琳琳， 等. 凝膠滲透色譜凈化-氣相色譜-串聯質譜法檢測輻照肉制品中2-十二烷基環丁酮[J]. 肉類研究， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

SHAO Biao， ZHOU Xiaolan， WANG Linlin， et al. Detection of 2-dodecylcyclobutanone in irradiated meat products by gel permeation chromatography followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Meat Research， 2020， 34（4）： 53-57. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200220-040. ? ?http：//www.rlyj.net.cn

食品輻照是以輻射技術為基礎，運用X射線、γ射線或高速電子束等電離輻射產生的高能射線對食品進行加工處理的一種殺菌及保藏技術，能夠起到殺蟲、殺菌、抑制生理過程的作用，實現提高食品衛生質量、延長貯藏期的效果[1-3]。輻照技術屬于冷加工技術，可以在常溫或低溫條件下進行，因此在食品加工領域具有巨大的應用價值[4-5]。然而，食品輻照過程中的能量傳遞會引發產生自由基以及一系列化學和生物效應，并伴隨物質的降解和輻解副產物的生成[5-7]。因此，輻照食品存在一定的爭議，一方面來自于輻照處理產生的未知副產物，存在潛在安全隱患;另一方面，食品固有的營養成分，如維生素、蛋白質等會遭到破壞或降解，降低其生理價值，影響食品品質[8-9]。根據各國多年的研究結果，低劑量輻照對食品成分變化的影響非常細微，聯合國糧農組織/世界衛生組織/國際原子能機構組織的聯合專家委員會于1980年10月宣布，吸收劑量10 kGy以下的任何輻照食品都是安全的，無需作毒理學實驗[10]。多個國家依據10 kGy為劑量上限，為不同食品制定相應的輻照標準，允許輻照技術用于食品加工，但需要有輻射標識明示，并且不允許重復輻照。當前，輻照技術已廣泛應用于脫水蔬菜、香辛料、谷物、水果、花粉、大蒜、畜禽肉、水產品、速溶茶等食品中。但是，在輻照加工領域，為追求更好的食品衛生質量，存在超劑量輻照、重復輻照等違法輻照亂象，帶來一定的安全風險;同時，還有少部分輻照食品未按規定進行標識，侵害消費者知情權。因此，對于輻照食品，尤其是違法輻照食品的監測和甄別具有重要意義。

輻照食品的鑒別方法有很多，如針對輻解化學產物的色譜法和色譜-質譜聯用法[11-14]、針對輻照產生自由基的電子自旋共振檢測法[15-16]、基于發光現象的熱釋光法、光致發光法和化學發光法[17-19]以及基于輻照引起DNA變化的DNA彗星法和熒光定量聚合酶鏈式反應法[20-21]等。對輻照肉制品而言，由于肉制品所含的脂肪酸經輻照后能夠形成標志性輻解產物2-十二烷基環丁酮（2-dodecylcyclobutanone，2-DCB），因此被用于該類食品鑒別[22-23]。目前，2-DCB的分析方法包括氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法、液相色譜-串聯質譜法、酶聯免疫吸附測定等[24-26]，

其中以GC-MS最為常用，現行的NY/T 2215—2012

《含脂輻照食品鑒定 氣相色譜質譜分析 2-烷基環丁酮法》[27]和GB 21926—2016《食品安全國家標準 含脂類輻照食品鑒定 2-十二烷基環丁酮的氣相色譜-質譜分析法》[28]

均采用該方法，前處理通過索氏抽提、硅膠層析柱凈化、氮吹濃縮等步驟進行提取凈化，過程較為繁瑣。

凝膠滲透色譜（gel permeation chromatography，GPC）是一種食品分析領域樣品前處理凈化的有效手段，其原理是根據分子質量大小實現不同化合物的分離，能夠有效去除基質中的脂肪、蛋白質、色素、多糖等大分子成分[29]。GPC可以與定量濃縮裝置在線聯用，操作簡單便捷且可實現自動化處理，同時色譜柱能夠反復使用。

針對輻照肉制品中2-DCB的檢測，本研究嘗試以GPC進行凈化處理，并利用具有更高靈敏度的氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）多反應監測（multi reaction monitoring，MRM）模式進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉制品（調味豬肉、豬軟骨、雞肉）購于當地市場，輻照樣品委托南通市邁克爾輻照有限公司采用60Co γ射線處理。

2-DCB標準品（純度≥95%） 美國Sigma-Aldrich公司;正己烷（純度95%，色譜級）、環己烷（純度≥99.8%）、乙酸乙酯（純度≥99.8%，色譜級） 德國CNW公司;無水硫酸鈉（分析純） 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000D GC-MS/MS儀 美國Agilent公司;Freestyle樣品處理系統（含在線固相萃取/GPC/EVA定量濃縮裝置） 德國LC-Tech公司;Milli-Q超純水裝置 ? 美國Millipore公司;AL204/01電子天平 瑞士Mettler Toledo公司;KQ 5200DE超聲波儀 昆山市超聲儀器有限公司;0.22 μm有機微孔濾膜 上海安譜實驗科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品提取

將樣品粉碎，稱取約20 g（精確至0.000 1 g），加入100 mL正己烷，超聲提取30 min，10 000 r/min離心15 min，收集上清液，加入10 g無水硫酸鈉靜置10 min，過濾后用正己烷重新定容至100 mL，獲得樣品提取液。

1.3.2 GPC處理

樣品提取液使用Freestyle樣品處理系統進行GPC純化。GPC條件：GPC色譜柱（32 cm×2.5 cm），填料為Bio-Beads SX3（200～400 目）;流動相：體積比1∶1的環己烷-乙酸乙酯;流速5.0 mL/min;進樣量5.0 mL;紫外檢測波長254 nm;棄去前15 min流出液，收集16～46 min流分，淋洗3 min。

1.3.3 在線濃縮

所收集的流分通過EVA在線濃縮裝置分兩步濃縮，溫度參數：水加熱溫度40 ℃，錐底部溫度42 ℃;第1步濃縮至5 mL，用2 mL流動相清洗2 次，真空度16 kPa;第2步濃縮至3 mL，用1 mL流動相清洗2 次，真空度18 kPa;氮吹至近干，用正己烷定容至1 mL，即得樣品待測液。

1.3.4 GC-MS/MS測定條件

GC條件：HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）;

載氣：He;流速1 mL/min;進樣口溫度260 ℃;升溫程序：100 ℃保持1 min;20 ℃/min升溫至160 ℃;2 ℃/min升溫至200 ℃;20 ℃/min升溫至300 ℃，保持5 min;進樣體積1 μL;分流方式：不分流。

MS/MS條件：電子轟擊離子源，離子源溫度230 ℃;一級MS四極桿溫度150 ℃，二級MS四極桿溫度150 ℃;電離能量70 eV;分辨率1.2 u;溶劑延遲時間6 min;傳輸線溫度280 ℃;碰撞氣（N2）流量1.5 mL/min;淬滅氣流量2.25 mL/min。

1.3.5 標準曲線、檢出限及定量限測定

以正己烷為溶劑，將2-DCB配制成質量濃度2 mg/L

的標準溶液，并稀釋成10、25、50、100、500、1 000 μg/L系列標準工作液，利用所確定的色譜條件和質譜參數進行分析，以標準溶液質量濃度為橫坐標，對應的定量離子對峰面積為縱坐標，得出標準工作曲線方程。取不含2-DCB的基質樣品，加入2-DCB標準溶液（添加量10 μg/kg），按照所建立的方法重復測定10 次，以結果標準偏差的3 倍計算方法檢出限，以結果標準偏差的10 倍計算定量限。

1.3.6 回收率與精密度測定

在未經輻照肉制品（調味豬肉、豬軟骨、雞肉）中分別添加25、100、400 μg/kg 3 個水平的2-DCB標準溶液，利用所建立的方法進行分析，平行測定6 次，計算回收率與相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.7 結果計算

樣品中2-DCB含量按下式計算。

式中：ρ、ρ0分別為根據標準曲線方程求得的樣品待測液及未經輻照的空白對照樣品中2-DCB質量濃度/（μg/L）;m為樣品質量/g。

2 結果與分析

2.1 樣品提取與凈化處理

根據2-DCB的脂溶性特征，同時參照NY/T 2215—2012

和GB 21926—2016，選擇正己烷作為提取溶劑。肉制品基質復雜，樣品提取過程不可避免帶來蛋白質、脂肪等雜質，不僅會對后續分析檢測結果造成干擾，還會帶來污染，影響儀器使用。2-DCB相對分子質量為238，采用GPC凈化處理以去除肉制品基質中脂肪、蛋白質等大分子成分。結果表明，在本研究參數條件下，前16 min內大分子物質能夠被有效去除，40 min內化合物被全部洗脫。為提高回收率同時避免不同樣品基質帶來的不確定性，在16～46 min收集色譜流分。此外，由于GPC凈化對樣品具有稀釋效應，使用在線定量濃縮裝置對凈化后樣品進行濃縮。

2.2 色譜條件與質譜參數優化

根據2-DCB的極性，選用弱極性的HP-5MS色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）進行分析，在確定的色譜分析條件下，利用全掃描模式獲得一級質譜圖。

由圖1可知，一級質譜圖中豐度較高的離子為m/z 98.1、

m/z 112.2，分別以其作為母離子，通過設定不同碰撞電壓進行碰撞，比較所獲得離子對的豐度大小。選擇豐度較高的4 對離子對作為MRM離子對進行監測。經過優化，確定2-DCB的MRM參數如表1所示。以豐度最高的離子對m/z 98.1>83.1作為定量離子對，其余離子對作為定性離子對。

2.3 標準曲線、檢出限和定量限

利用GC-MS/MS的MRM模式分析2-DCB標準溶液，所得總離子流圖和定量離子流圖如圖2所示。所得標準曲線方程為y=383 709.18x-4 686.41，相關系數為0.998 3，方法檢出限和定量限分別為1.8、6.0 μg/kg。

2.4 回收率和精密度

由表2可知，樣品平均加標回收率為78.2%～105.5%，RSD為1.3%～7.3%，表明該方法準確度和精密度較高，能夠較好地測定肉制品中2-DCB含量。

2.5 樣品測定

利用本研究所建立的方法分析0、10、20 kGy輻照劑量下調味豬肉、豬軟骨、雞肉中2-DCB的含量，通過比較目標色譜峰與標準物質的保留時間及相應子離子豐度比進行定性，通過標準曲線方程計算2-DCB含量，20 kGy輻照劑量下樣品離子流圖如圖3所示。

A～C. 分別為調味豬肉、豬軟骨和雞肉;

下標1～2. 分別為總離子流圖和定量離子流圖。

由表3可知，未經輻照樣品中2-DCB均未檢出，印證了其可作為含脂類輻照食品鑒別的化學標志物。對于同一樣品，2-DCB含量與輻照劑量具有相關性，輻照劑量越大，2-DCB含量越高，因此，2-DCB含量可以用作超劑量輻照的判別依據。

3 結 論

采用GPC對樣品進行凈化處理，利用GC-MS/MS的MRM模式，建立輻照肉制品中2-DCB檢測方法。基質樣品加標回收實驗和精密度實驗結果證實了方法的可行性和準確性。本方法在前處理過程中，利用GPC與定量濃縮裝置在線聯用，實現自動批量處理，避免了現行標準中復雜的操作過程;在分析步驟中，采用GC-MS/MS的MRM模式進行分析，相較于GC-MS法具有較高靈敏度，同時，篩選出多對離子對進行監測，有利于更加準確地定性，避免假陽性結果。

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收稿日期：2020-02-20

基金項目：國家質量監督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2015QK060）;

江蘇省質量技術監督“352專業技術人才培養工程”資助項目;南通市“226高層次人才培養工程”資助項目

第一作者簡介：邵彪（1983—）（ORCID： 0000-0001-8749-889X），男，高級工程師，博士，研究方向為食品質量與安全分析。

E-mail： shaobiao1983@sina.com

通信作者簡介：陳剛（1967—）（ORCID： 0000-0002-1817-205X），男，教授級高級工程師，碩士，研究方向為食品質量與安全分析。E-mail： 1351292318@qq.com