梔子葉片愈傷組織誘導優(yōu)化研究

田亞 徐志超 胡開治

摘要 目的：對梔子（Gardenia jasminoides Ellis）葉片愈傷組織誘導進行優(yōu)化研究。方法：通過以葉片為外植體，MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合（6-BA、NAA和IBA）進行愈傷組織誘導研究。結(jié)果：梔子葉片在WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L以及6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1（或0.5）mg/L中均有100%的誘導率;在MS培養(yǎng)基上，MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L的誘導率最好，分別為70%和74%。梔子葉片愈傷組織在再分化培養(yǎng)基上均未誘導出叢生芽。結(jié)論：WPM培養(yǎng)基比MS培養(yǎng)基更易誘導梔子葉片愈傷組織，且梔子愈傷組織的再分化較困難。

關鍵詞 梔子;葉片;愈傷組織誘導;MS培養(yǎng)基;WPM培養(yǎng)基;6-BA;NAA;IBA

Abstract Objective：To study the optimization of leaf callus induction in Gardenia jasminoides Ellis.Methods：The callus induction was studied using leaves as explant，MS and WPM as basic medium adding different hormone combinations（6-BA，NAA and IBA）.Results：Gardenia leaves had a 100% of callus induction rate in WPM+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L or 6-BA1.0 mg/L+NAA 0.1（or 0.5）mg/L，while 70% and 74% were the best induction rates in MS+6-BA 1.0（or 1.5）mg/L+NAA 0.5 mg/L，respectively.The leaf callus of Gardenia did not induce cluster buds in the redifferentiation medium.Conclusion：Compared with MS medium，the callus was easy to be induced in WPM medium，and the redifferentiation of Gardenia callus was difficult.

Keywords Gardenia jasminoides Ellis; leaves; Callus induction; MS medium; WPM medium; 6-BA; NAA; IBA

梔子（Gardenia jasminoides Ellis），為茜草科梔子屬多年生常綠灌木，生于丘陵山谷或山坡灌叢中，分布于江蘇、安徽、浙江、江西、福建和貴州等地[1]。其干燥成熟果實是傳統(tǒng)中藥，屬原衛(wèi)生部頒布的第一批藥食兩用資源，性味苦寒，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒、消腫止痛等功效，主要活性物質(zhì)有環(huán)烯醚萜類（梔子苷）、二萜色素類（西紅花苷和西紅花酸）、有機酸類（綠原酸和熊果酸）和油脂類等[2]。其中，從梔子成熟果實提取的黃色素著色力強、安全性高、成本較低，且有一定的保健和營養(yǎng)價值，可廣泛應用于食品、飲料、醫(yī)藥和化妝品等領域，是國際上允許生產(chǎn)和使用的天然食用黃色素[3-4]。此外，梔子花朵美麗、花香沁人心脾，是園林塑景以及發(fā)展休閑和觀光農(nóng)業(yè)的優(yōu)勢物種[5]。梔子集藥用、食用及觀賞價值于一體，應用前景十分廣闊。建立梔子組培體系，對梔子優(yōu)良品種選育及保存具有重要意義。

在麻瘋樹的組織培養(yǎng)研究中，趙雪惠等[6]以幼胚為外植體，去除胚乳，接種于4種（MS、LM、WPM和N6）未添加任何植物激素的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，在MS與WPM培養(yǎng)基上能夠大量誘導出愈傷組織，并且WPM培養(yǎng)基上分化出不定芽數(shù)量最多。以WPM為基本培養(yǎng)基，添加激素組合6-BA與NAA如懸鈴木[7]和青錢柳[8]，或添加激素組合6-BA與IBA如大果櫸[9]和胡楊[10]，均可誘導愈傷組織、叢生芽，最后得到再生植株。在梔子的組織培養(yǎng)研究中，多以MS為基本培養(yǎng)基，篩選梔子組織培養(yǎng)最適激素配比[11-12]，未見采用WPM培養(yǎng)基的研究。因此，本研究擬以MS及木本植物培養(yǎng)基WPM為基本培養(yǎng)基，添加激素6-BA、NAA和IBA，對梔子葉片愈傷組織誘導、愈傷組織再分化進行研究，進一步完善梔子組織培養(yǎng)體系，為梔子優(yōu)良品種選育和保存、梔子功能基因組研究奠定基礎。

1 材料

梔子取自重慶市藥物種植研究所培育的優(yōu)良品種ZZ1-9的扦插盆栽苗。選取生長狀態(tài)良好，無黃葉無病態(tài)的梔子幼嫩莖尖為材料。

所需植物激素為6-芐氨基嘌呤（6-BA，華綠源科技有限公司，北京），萘乙酸（NAA，華綠源科技有限公司，北京），吲哚丁酸（IBA，華綠源科技有限公司，北京），所需基本培養(yǎng)基為MS（Murashige & Skoog with Vitamins，Caisson labs，美國，批號：0619003）和WPM（McCown Woody Plant medium with vitamins，COOLABER，中國，批號：PM28151421）培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 獲取無菌外植體 選取梔子幼嫩莖尖2～3 cm為外植體，自來水沖洗干凈后在超凈工作臺中進行后續(xù)滅菌操作。先用75%酒精浸泡30 s，無菌水洗3次，再用2%次氯酸鈉消毒10～15 min，無菌水洗5～6次。將消過毒的外植體放在無菌濾紙上吸干表面水分，接種到不添加激素的MS培養(yǎng)基上啟動培養(yǎng)，后轉(zhuǎn)入無菌苗培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，無菌苗培養(yǎng)基[13]為MS+6-BA 1 mg/L+IBA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8。

2.2 葉片愈傷組織誘導 將梔子無菌苗葉片剪掉邊緣后剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，使用無菌鑷子接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基，以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA和NAA的激素組合（見表1中YA1-10）。培養(yǎng)30 d后記錄梔子葉片在不同激素組合以及在MS和WPM 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織誘導情況。愈傷組織誘導率=（長出愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù)）×100%。

2.3 愈傷組織再分化的誘導 將MS培養(yǎng)基上誘導產(chǎn)生的綠色愈傷組織切分成0.5 cm×0.5 cm的小塊，分別接種于愈傷組織再分化培養(yǎng)基上，以MS和WPM為基本培養(yǎng)基，附加不同濃度6-BA和IBA的激素組合（見表1中YB1-10）。培養(yǎng)30 d后記錄梔子葉片在不同激素組合以及在MS和WPM 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織再分化情況。愈傷組織再分化率=（再分化的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織總數(shù)）×100%。

3 結(jié)果

3.1 MS培養(yǎng)基附加不同激素組合對梔子葉片愈傷組織形成的影響 MS培養(yǎng)基上添加激素6-BA和NAA不同配比對梔子葉片愈傷組織的誘導情況如圖1所示。MS培養(yǎng)基若不添加任何激素則無愈傷組織產(chǎn)生。添加不同激素配比的培養(yǎng)基均可誘導愈傷組織，但愈傷組織誘導率及愈傷組織狀態(tài)有較大差異。在愈傷組織誘導率方面，YA10、YA7的愈傷組織誘導率較高，分別為74.7%、70.7%。從愈傷組織生長情況來看，在YA4中多為白色，其余處理中多為綠色致密。在YA2和YA3中的愈傷組織，到后期愈傷組織生長緩慢，在YA4、YA7和YA10中愈傷組織生長較快。綜合考慮愈傷組織誘導率及愈傷組織生長情況，梔子葉片適宜的MS愈傷組織誘導培養(yǎng)基為YA7和YA10，即為MS+6-BA 1.0（或1.5）mg/L+IBA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L，pH=5.8。

3.2 WPM培養(yǎng)基附加不同激素組合對梔子葉片愈傷組織形成的影響 WPM培養(yǎng)基添加激素6-BA和NAA不同配比對梔子葉片愈傷組織的誘導情況如圖2所示。WPM培養(yǎng)基若不添加任何激素，和MS培養(yǎng)基一樣，均無愈傷組織產(chǎn)生。WPM培養(yǎng)基的誘導率遠高于MS培養(yǎng)基，YA4、5和7的愈傷組織誘導率均達到100%，且在添加激素的處理中誘導率均超過80%。其中，YA2、5和8整體為綠色、較小愈傷組織;YA4、7和10多是在愈傷組織底部為綠色致密、邊緣為白色疏松，且大部分愈傷組織生長較快。

3.3 MS培養(yǎng)基附加不同激素組合對愈傷組織再分化的影響 MS培養(yǎng)基添加激素6-BA和IBA不同配比對梔子葉片愈傷組織再分化情況見圖3（A）所示。葉片誘導的愈傷組織在添加激素6-BA和IBA不同配比的MS培養(yǎng)基上均未誘導出叢生芽。

3.4 WPM培養(yǎng)基附加不同激素組合對愈傷組織再分化的影響 WPM培養(yǎng)基添加激素6-BA和IBA不同配比對梔子葉片愈傷組織再分化情況見圖3（B）所示。葉片誘導的愈傷組織在添加激素6-BA和IBA不同配比的WPM培養(yǎng)基上均未誘導出叢生芽。

4 討論

WPM是木本植物組織培養(yǎng)優(yōu)選培養(yǎng)基，多種木本植物以WPM為基本培養(yǎng)基建立再生體系，如喜樹[14]，中國李[15]、茶條槭[16]等。然而，梔子組培體系研究多以MS為基本培養(yǎng)基，還未見以WPM為基本培養(yǎng)基的研究。本研究以梔子葉片為外植體，MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同激素組合的6-BA和NAA或IBA，進行葉片愈傷組織誘導及愈傷組織再分化研究，對梔子葉片愈傷組織誘導進行優(yōu)化。梔子葉片在MS和WPM培養(yǎng)基不添加任何激素的情況下，均無愈傷組織產(chǎn)生，而在添加不同激素配比的培養(yǎng)基上，雖然誘導率以及愈傷組織生長狀態(tài)有所差異，但均有愈傷組織產(chǎn)生，表明植物激素在愈傷組織的誘導中起著重要作用。梔子葉片在WPM培養(yǎng)基上的誘導率遠高于MS培養(yǎng)基，在添加不同激素配比的WPM培養(yǎng)基上均超過80%，而在MS培養(yǎng)基上，愈傷組織的最高平均誘導率為74.7%。但在MS培養(yǎng)基上誘導的愈傷組織多為綠色致密，在WPM培養(yǎng)基上誘導的愈傷組織多為白色疏松。以MS培養(yǎng)基上誘導的綠色愈傷組織為材料，接種于添加6-BA和IBA不同激素組合的MS和WPM的再分化培養(yǎng)基上，均無愈傷組織再分化。

本研究以固體MS及WPM為基本培養(yǎng)基，梔子葉片誘導愈傷組織材料，添加6-BA及IBA并未誘導出叢生芽。而張慶紅等[17]研究表明用梔子種子愈傷組織可通過MS液體培養(yǎng)分化出芽，添加的激素TDZ是一種新型的植物生長調(diào)節(jié)劑，已成功地用于多種植物不定芽的誘導，對于木本植物的不定芽誘導具有突出的效果[18]。因此，可進一步采用MS或WPM培養(yǎng)基上添加TDZ，以液體培養(yǎng)方式對梔子葉片愈傷組織進行不定芽誘導。

梔子所含西紅花苷及西紅花酸，是色素類物質(zhì)，不僅可食用，亦是被譽為“紅色黃金”的名貴中藥材西紅花的主要活性物質(zhì)。西紅花入藥部位為柱頭，一朵西紅花僅有3個柱頭，柱頭產(chǎn)量低，且人工采收成本高，加上西紅花主產(chǎn)地在伊朗、希臘等國家，在我國資源短缺，導致西紅花價格昂貴[19]。而梔子栽培地廣，果實產(chǎn)量高，更適宜用來研究西紅花苷等活性物質(zhì)。所以，優(yōu)化梔子組培體系，可為建立梔子功能基因研究體系提供理論依據(jù)，對梔子所含活性物質(zhì)作用機制研究、梔子優(yōu)良品種選育及保存具有重要意義。

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（2020-02-10收稿 責任編輯：芮莉莉）