補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠模型相關(guān)蛋白表達(dá)的作用

李紅云 王中琳

摘要 目的：研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT表達(dá)的作用。方法：選取90只SD大鼠，以隨機(jī)抽簽法分成模型組、正常對(duì)照組及補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。模型組與補(bǔ)陽(yáng)還五湯組建立腦出血模型，造模后第2 d。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組行補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃，模型組行生理鹽水灌胃，給藥14 d。比較3組MMP-9、TIMP-1、Glu，腦組織PI3K、AKT以及Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)。結(jié)果：補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、模型組的MMP-9、TIMP-1、Glu均高于正常對(duì)照組，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組MMP-9、Glu低于模型組，而TIMP-1高于模型組（均P<0.05）;補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、模型組腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組更高，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)較模型組更高（均P<0.05）;補(bǔ)陽(yáng)還五湯組、模型組腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)均高于模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)較模型組更高（均P<0.05）。結(jié)論：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可改善腦出血大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu，可由激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控Bcl-2、BAX表達(dá)，繼而發(fā)揮保護(hù)腦組織作用。

關(guān)鍵詞 腦出血;補(bǔ)陽(yáng)還五湯;PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;基質(zhì)金屬蛋白酶-9;基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1;大鼠;相關(guān)蛋白;腦組織

Abstract Objective：To investigate and analyze the effects of Buyanghuanwu Decoction on the expression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9），matrix metalloproteinase inhibitor-1（TIMP-1），glutamate（Glu），PI3K and AKT in rats with cerebral hemorrhage.Methods：A total of 90 SD rats were selected and divided into a model group，a normal control group and Buyang Huanwu Decoction group by random lottery.Rats in the model group and the Buyang Huanwu Decoction group were given the cerebral hemorrhage model.Starting from 2 d after the model，the Buyang Huanwu Decoction group was given the gavage treatment of Buyang Huanwu Decoction，while the model group was given normal saline and continuous administration for 14 d.The expression levels of MMP-9，TIMP-1，Glu，PI3K，and AKT，Bcl-2，BAX in brain tissues of the 3 groups of rats were compared.Results：The levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group，and the levels of MMP-9 and Glu in the Buyang Huanwu Decoction group were lower than those in the model group while the TIMP-1 was higher than those in the model group（all P<0.05）.The expression levels of PI3K and AKT in the brain tissues of rats in the Buyang Huanwu Decoction group and the model group were higher than those in the normal control group.PI3K、AKT protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction were higher than those in the model group（all P<0.05）.Bcl-2 and BAX protein expression levels in brain tissues of rats in Buyang Huanwu Decoction group were higher than those in model group（both P<0.05）.Conclusion：Buyang Huanwu Decoction can significantly improve the levels of MMP-9，TIMP-1 and Glu in rats with cerebral hemorrhage，which may further regulate the expression of Bcl-2 and BAX proteins by activating the PI3K/AKT signal transduction pathway，thereby playing a role in protecting brain tissue.

Keywords Cerebral hemorrhage; Buyang Huanwu Decoction; PI3K/AKT signal transduction pathway; Matrix metalloproteinase-9; Matrix metalloproteinase inhibitor-1; Rats; Related protein; Brain tissue

腦出血主要是指原發(fā)性腦實(shí)質(zhì)出血，在所有卒中疾病中占10%～15%，且多發(fā)于基底節(jié)區(qū)[1]。該病具有發(fā)病急、死亡率高以及致殘率高的特點(diǎn)，屬于腦卒中最為嚴(yán)重的類型之一，其中腦出血誘發(fā)的神經(jīng)元凋亡以及繼發(fā)性腦水腫，在神經(jīng)功能損傷過程中起著至關(guān)重要的作用[2]。而隨著近年來相關(guān)研究的逐漸深入，越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了細(xì)胞增殖、分化以及抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡等過程[3]。目前，臨床上已有研究報(bào)道[4]證實(shí)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的使用可有效激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而改善腦出血患者臨床癥狀，但其效果并不十分理想。因此，尋找一種更加安全有效的治療方式顯得尤為重要，亦是目前臨床研究的重點(diǎn)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯屬于中藥制劑，具有補(bǔ)氣活血通絡(luò)的功效，目前已被廣泛應(yīng)用于腦卒中及其后遺癥的治療過程中，且效果顯著[5]。然而，關(guān)于補(bǔ)陽(yáng)還五湯是否會(huì)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生影響，臨床研究較少。鑒于此，本研究通過研究補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)腦出血大鼠模型基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、谷氨酸（Glu）及PI3K、AKT蛋白表達(dá)的作用并予以分析，旨在明確補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療腦出血的作用機(jī)制，繼而為其臨床應(yīng)用提供更佳的理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取90只清潔級(jí)SD大鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，均為我院實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的6～8周大鼠。

1.1.2 藥物 1）補(bǔ)陽(yáng)還五湯：生黃芪120 g，川芎、赤芍各4.5 g，干地龍、紅花、桃仁各3 g，當(dāng)歸尾6 g。由我院藥房以水煎醇沉法制備質(zhì)量濃度為5.0 g/mL的提取物，保存在4 ℃恒溫箱中備用。2）生理鹽水（上海研生生化試劑公司）。

1.1.3 試劑與儀器 1）水合氯醛（上海生工公司，型號(hào)：A600288）;2）大鼠腦立體定向儀（北京東方德教育科技公司，型號(hào)：m155673）;3）微量注射器（北京英偉達(dá)公司，型號(hào)：Hamilton 7000）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取90只清潔級(jí)SD大鼠作為試驗(yàn)對(duì)象，將其以隨機(jī)抽簽法等分成模型組、正常對(duì)照組以及補(bǔ)陽(yáng)還五湯組。其中模型組大鼠雌性16只，雄性14只;周齡6～8周，平均周齡（7.36±0.24）周;體質(zhì)量91～136 g，平均體質(zhì)量（110.52±19.78）g。正常對(duì)照組大鼠雌性17只，雄性13只;周齡6～8周，平均周齡（7.44±0.25）周;體質(zhì)量96～135 g，平均體質(zhì)量（110.50±19.72）g。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠雌性18只，雄性12只;周齡6～8周，平均周齡（7.40±0.26）周;體質(zhì)量94～136 g，平均體質(zhì)量（110.47±19.90）g。3組大鼠性別、周齡、體質(zhì)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究已得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理審批號(hào)：019247）。腦出血大鼠模型的建立：通過Rosenberg法完成大鼠模型制備。即首先采用10%的水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉，使用劑量為400 mg/kg，并將大鼠固定在立體儀上，選擇頭部正中作縱行切口，剝離大鼠骨膜，保證其冠狀縫與前囪暴露。選擇前囪前2 mm處以及中線右側(cè)3 mm處分別鉆1 mm直徑的小孔。采用微量注射器自股動(dòng)脈內(nèi)抽取適量的血液，在立體定向儀的幫助下，順著鉆孔垂直進(jìn)針6 mm左右，緩慢注入血液80 μL，留針10 min后撤針，并對(duì)切口進(jìn)行消毒縫合。

1.2.2 干預(yù)方法 正常對(duì)照組僅裸露頸總動(dòng)脈與神經(jīng)。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組從造模后第2天開始予以26 g/（kg·d）劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯灌胃治療;模型組大鼠從造模后第2天開始予以等量的生理鹽水灌胃;2組均連續(xù)給藥14 d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 比較3組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平，腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平，腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平。采用免疫組化法測(cè)定MMP-9、TIMP-1、Glu水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，相關(guān)試劑盒具購(gòu)自北京中山金橋生物技術(shù)有限公司;采用免疫組化法檢測(cè)大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白以及Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，相關(guān)試劑盒具購(gòu)自上海雅吉生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料用百分比/率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平比較 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常對(duì)照組，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組MMP-9、Glu水平低于模型組，而TIMP-1水平高于模型組（均P<0.05）。見表1。

2.2 3組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平比較 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平較正常對(duì)照組高，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平較模型組高（均P<0.05）。見表2，圖1。

2.3 3組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平比較 補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平均高于模型組，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平較模型組高（均P<0.05）。見表3，圖2。

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腦出血當(dāng)屬“中風(fēng)”范疇，主癥為突然昏撲、語(yǔ)言障礙、口舌歪斜以及偏身麻木等[6-8]。針對(duì)該病病因我國(guó)中醫(yī)學(xué)歷代醫(yī)家的論述較多，其中唐宋之前多以“外風(fēng)”立論，強(qiáng)調(diào)“內(nèi)虛邪中”。唐宋之后則以“內(nèi)風(fēng)”立論，強(qiáng)調(diào)“正氣之虛”“痰濕生熱”以及“心火暴甚”等。清代名醫(yī)王清任則提出中風(fēng)乃是“氣虛血瘀”所致，遂立補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療偏癱。近代醫(yī)家張伯龍等則認(rèn)為該病的發(fā)生主要為陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，直沖犯腦[9-11]。病理機(jī)制乃是本虛標(biāo)實(shí)、氣血逆亂、上盛下虛致使運(yùn)化失調(diào)。且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，腦出血后血腫周圍存在一個(gè)組織損傷以及水腫形成進(jìn)行性加重區(qū)域，與缺血暗半帶類似，該部位的腦組織病理改變可在特定時(shí)間內(nèi)可逆，若能于此時(shí)間窗內(nèi)予以積極有效的治療，可促使受損的組織功能恢復(fù)[12-14]。

MMP-9的過度表達(dá)會(huì)對(duì)基底膜完整性造成破壞，進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)血管細(xì)胞的凋亡，引起出血。而TIMP-1屬于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）內(nèi)源性抑制劑，其可通過和MMP-9得催化區(qū)以1∶1的比例可逆性結(jié)合，進(jìn)一步降低MMP-9的活性，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)功能的目的。Glu屬于腦缺血興奮性中毒分子標(biāo)記物之一，機(jī)體一旦發(fā)生腦出血，則會(huì)導(dǎo)致突出前膜去極化，進(jìn)一步促使神經(jīng)元釋放Glu至細(xì)胞外液中，且神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元攝取Glu的功能可能因缺血導(dǎo)致的能量衰竭而促使細(xì)胞外Glu水平升高[15-17]。同時(shí)，腦缺血會(huì)引起ATP合成缺乏，從而降低了Glu滅能，導(dǎo)致胞外Glu含量增加，使得神經(jīng)元興奮性持續(xù)增高，大量釋放Glu。形成惡性循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠MMP-9、TIMP-1、Glu水平均高于正常對(duì)照組，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組MMP-9、Glu水平低于模型組，而TIMP-1水平高于模型組（均P<0.05），提示了補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過改善腦出血模型大鼠的MMP-9、TIMP-1、Glu水平，進(jìn)一步發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞功能的目的。分析原因，作者認(rèn)為補(bǔ)陽(yáng)還五湯中的赤芍、桃仁、紅花以及川芎具有活血化瘀的功效，而干地龍可疏通血脈，補(bǔ)氣活血，改善大鼠的腦血流，黃芪則具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水固表的功效。此外，腦出血后機(jī)體可能釋放一系列具有絡(luò)氨酸激酶活性受體激活的物質(zhì)，從而會(huì)與P13K的調(diào)節(jié)亞基進(jìn)行特異性結(jié)合，進(jìn)一步激活P13K，繼而促使細(xì)胞膜上的肌醇發(fā)生磷酸化，并生成第二信使[18-20]。Akt屬于P13K下游的效應(yīng)分子，P13K可通過與Akt的PH結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，從而促使Akt自細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜，同時(shí)促使其構(gòu)象的改變，進(jìn)一步使得Akt的多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，激活A(yù)kt。而活化的Akt可通過磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白，從而實(shí)現(xiàn)多種生長(zhǎng)因子的調(diào)控，以此誘發(fā)細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞存活[21-23]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平相較正常對(duì)照組較高，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織PI3K、AKT蛋白表達(dá)水平較模型組高（均P<0.05），提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用。另外，Bcl-2屬于抗凋亡基因之一，而BAX屬于重要的粗凋亡基因，后者的過表達(dá)會(huì)抑制前者的表達(dá)，進(jìn)一步引起細(xì)胞凋亡[24-26]。而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：補(bǔ)陽(yáng)還五湯組與模型組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平均高于模型組，且補(bǔ)陽(yáng)還五湯組大鼠腦組織Bcl-2、BAX蛋白表達(dá)水平較模型組高（均P<0.05），提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯可能是通過增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制BAX蛋白的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，保護(hù)腦出血的作用。究其原因，作者認(rèn)為可能是補(bǔ)陽(yáng)還五湯在有效降低血腦屏障通透性的同時(shí)，激活了PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而促進(jìn)復(fù)合物的形成，進(jìn)一步增加了胞質(zhì)中的Bcl-2游離狀態(tài)，以此發(fā)揮抗凋亡作用[27]。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可有效改善腦出血大鼠模型MMP-9、TIMP-1、Glu水平，激活PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)一步調(diào)控Bcl-2、BAX蛋白的表達(dá)，可能是該藥治療腦出血的重要機(jī)制之一。

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