骨復生對激素性股骨頭壞死大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表達的影響*

王軍威 ，劉德玉，歐國峰，董 博 ，袁普衛(wèi) ，王國柱，肖 斌，陳 瑞，YAROV ABDULRAKHIM(哈薩克斯坦)

1.陜西中醫(yī)藥大學(咸陽 712000)；2.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院(咸陽 712000)；3.陜西中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨科(咸陽 712046)

激素性股骨頭壞死(Steroid-indueed avascular necrosis of the femoral head,SANFH)屬非創(chuàng)傷性股骨頭壞死，常見原因為股骨頸骨折、激素及酒精，屬骨壞死中最常見的一類，其致殘率極高，嚴重影響人們的生活質量及水平[1-4]。祖國醫(yī)學認為股骨頭壞死屬“骨蝕”、“骨痿”等范疇，股骨頭部絡脈細微，氣血不足，外感六淫及內生五邪引起骨絡不通，經(jīng)氣不得以上乘養(yǎng)筋骨，骨失津潤而致萎痹；反之經(jīng)絡運行暢通，氣血得以上乘，骨受氣血津潤，則經(jīng)絡通、骨萎痹除。成骨-成血管偶聯(lián)是指血管再生與骨生成這兩種生物學進程：由血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)軸調控的成骨-成血管偶聯(lián)來維持骨微環(huán)境的平衡，不管成骨還是成血管偶聯(lián)受損均可致骨的發(fā)育與重塑受限[5-7]。那么，骨復生是否通過影響成骨-成血管偶聯(lián)調控因子(BALP-VEGF-BGP) 對早中期激素性股骨頭壞死起到治療作用的，目前不得而知。因此，本研究擬通過動物實驗觀察骨復生對早中期激素性股骨頭壞死的可能作用機理及對血清中血管內皮生長因子(VEGF)、骨堿性磷酸酶(Bone alkaline phosphatase,BALP)、骨鈣素(Bone Gla-protein,BGP)的影響，以期為中醫(yī)藥防治股骨頭壞死提供一定的理論依據(jù)。

材料與方法

1 動 物 160只4月齡普通級SD大鼠(雌雄各半)，體重約在(280±40) g。所有動物均按中國動物實驗標準進行采購，由西安交大醫(yī)學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(陜)2017-004。

2 藥 物 骨復生膠囊(規(guī)格：0.4 g×50粒，50粒/瓶，由陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院中成藥房提供)由鹿角膠15 g，三七6 g，蟲、牛膝、延胡索各12 g，黃芪30 g等組成；阿侖膦酸鈉片(福善美)，國藥準字H10980109，石藥集團歐意藥業(yè)有限公司。

3 主要試劑與儀器 甲潑尼龍琥珀酸鈉，國藥準字H20040845,國藥集團容生制藥有限公司；Mouse VEGF ELISA Kit(批號:2695R)、Anti-BALP Antibody(批號:RT201)、Anti-BGP(Osteocalcin) Antibody，脂多糖，北京索萊寶科技有限公司；超速低溫離心機,德國(Eppendorf)；石蠟切片機,德國萊卡2135型；電子顯微鏡,日本(OLYMPUS)。

4 造模及干預方法

4.1 造模方法：建立早中期激素型股骨頭壞死模型，造模參照賀西京造模法[8]以及我們前期研究的方法[9]進行改良，中藥治療組、實驗對照組及模型組大鼠在喂養(yǎng)1周后給予尾靜脈注射脂多糖(50 μg/kg)，連續(xù)注射3 d后每隔2日進行甲潑尼龍琥珀酸鈉(20 mg/kg)臀肌注射(統(tǒng)一從右側臀大肌以45度角勻速注射)，隔日1次，連續(xù)注射8周后隨機抽取各組大鼠各2只進行股骨頭壞死模型鑒定，以股骨頭組織HE染色為參考，鏡下觀察其切片有空骨陷窩形成或骨細胞核聚集，伴有周圍骨髓細胞壞死征象，有1處壞死區(qū)域即可判斷造模成功[10]。

4.2 治療方法：造模成功后，中藥治療組給予骨復生膠囊水溶液2 ml(約480 mg/ml)灌胃治療，實驗對照組則給予2 ml(約1.29 mg/ml)阿侖膦酸鈉片水溶液灌胃治療，模型組給予生理鹽水2 ml灌胃治療，每天1次，連續(xù)灌胃8周。正常不給予治療，正常飼養(yǎng)2周后處死取材。

4.3 觀察指標及方法

4.3.1 影像學檢查:隨機抽取20只大鼠(每組各5只)，選取俯臥位，冠狀位，核磁共振(MRI)IR快速反轉序列掃描，觀察各組大鼠髖關節(jié)治療前后的影像學改變。

4.3.2 組織病理學檢測:各組股骨頭標本(雙側)沿股骨頭正中切開，固定24～48 h(4%多聚甲醛溶液)→脫鈣3～4周(10%EDTA)→包埋、切片、HE染色→觀察骨小梁結構、骨細胞等的結構形態(tài)變化(電子顯微鏡)。

4.3.3 血清骨代謝標志物(VEGF、BALP、BGP)表達情況:采用乙醚麻醉SD大鼠，待麻醉滿意后，用微量采血管從大鼠眼眶下靜脈叢處取血，將采血管置于低速離心機(4 ℃，3500 r/min)離心5 min后取得上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)分別對各組血清的相關骨代謝標志物進行檢測。

5 統(tǒng)計學方法 用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，結果以平均值±標準差表示，先以方差分析，若組間有差異，組間比較用q檢驗，方差不齊者采用秩和檢驗或者χ2檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 動物一般情況 空白組大鼠除了體重有所增加外，其他(精神狀況、毛發(fā)顏色等)均無明顯異常變化；模型組大鼠精神狀況比較差，毛發(fā)顏色晦暗并且沒有光澤，體重下降顯著，偶有毛發(fā)脫落等；中藥治療組、實驗對照組大鼠精神狀況尚可，毛發(fā)顏色較正常組稍差，體重輕微下降，但中藥組大鼠一般情況更接近于正常組。

2 各組大鼠雙側髖關節(jié)MRI圖像變化 空白組未見明顯異常信號；模型組股骨頭出現(xiàn)中點狀或片狀樣中高等信號，周圍環(huán)繞不均勻低信號，呈典型雙線征，關節(jié)腔內有少量積液；中藥治療組髖關節(jié)周圍偶有T2稍高信號，關節(jié)內未見T2高信號，股骨頭形態(tài)規(guī)則，與軟骨界限分明；實驗對照組可見髖關節(jié)周少許T2高信號，關節(jié)內偶有T2高信號，股骨頭形態(tài)尚規(guī)則，與軟骨界限大致分明(圖1)。

圖1 各組髖關節(jié)(冠狀位)MRI掃描結果(白色箭頭所指為差異性表達區(qū)域)

3 各組大鼠股骨頭HE染色后組織病理學改變空白組股骨頭軟骨厚度正常，軟骨細胞排列有序，結構整齊；模型組股骨頭軟骨細胞大面積出現(xiàn)壞死，排列不整齊，軟骨細胞核聚縮，骨小梁內骨細胞明顯減少，空骨陷窩明顯增多。中藥治療組股骨頭軟骨細胞排列尚規(guī)則，結構尚完整，少有空骨陷窩，但實驗對照組多見，與正常組有較大差異(P<0.05)(圖2)。

4 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量表達情況 見表1。中藥治療組和實驗對照組在治療8周后與模型組相比血清中VEGF、BALP、BGP含量表達均升高，且中藥治療組在治療8周后VEGF、BALP、BGP含量比實驗對照組升高更顯著，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明骨復生與阿侖磷酸鈉能同時升高血清中VEGF、BALP、BGP含量來增強成骨細胞活性，促進VEGF發(fā)揮其成血管作用，促進BALP、BGP升高增加成骨細胞活性，提高骨代謝率，促進骨質正常鈣化，隨著治療時間的延長，骨復生的療效更佳。

圖2 各組動物股骨頭光鏡下HE染色結果(HE染色,×400)

表1 各組大鼠血清中VEGF、BALP、BGP的含量表達情況

注:與模型組比較,*P<0.05;與實驗對照組治療8周后比較,△P<0.05

討 論

激素性股骨頭壞死又屬股骨頭壞死中最常見的類型[11-13]。屬骨科三大疑難病之一，且明確診斷后未及時正確治療2年內股骨頭塌陷率極高，而對于塌陷后的股骨頭及其臨床治療效果和預后均不甚理想[14]。如何正確選擇并進行早期的治療一直是骨科學術界的難題，早期診斷、選擇有效治療方法，如藥物的選擇或者保髖手術選擇，不僅可以減輕患者的臨床癥狀，延遲病程，還有治愈本病的可能，因此，本次研究具有重大意義。祖國醫(yī)學認為股骨頭壞死的局部表現(xiàn)是其全身性病變的一部分，患者存在全身性的改變，西醫(yī)治療本病以解決關節(jié)局部病變?yōu)橹?，然而臨床上患者體質差異、基礎疾病不同，其病因病機也有一定差異，僅考慮局部癥狀，不改善全身狀況，是無法治愈股骨頭壞死的。祖國醫(yī)學在辨證論治的理念及整體觀念規(guī)范下，將患者的局部表現(xiàn)與全身狀況進行點到面的統(tǒng)籌分析，得出明確的“證”，隨后針對性的用方，進行整體、綜合性調節(jié)，做到“標本兼治，多靶點作用”， 既能改善患者的整體狀況，又可以保留股骨頭，具有無法比擬的治療優(yōu)勢，大量的臨床及基礎研究資料也已證實其安全性和有效性[15-18]。目前，治療股骨頭壞死的中藥已達100種以上，因此，研究一組治療效率高、服用劑量小、使用方便、毒副作用底的特效中藥組合，勢在必行。

“骨復生”是陜西省名中醫(yī)劉德玉教授經(jīng)多年臨床經(jīng)驗總結出來治療股骨頭壞死的經(jīng)驗方，本著以“補腎活血”為大法，已成為陜中附院的院內治療多類股骨頭壞死并取得了顯著療效[19-21]的方法。方中三七和鹿角霜共為君藥，活血化瘀，補益肝腎；牛膝強壯筋骨，蟲破血化瘀，續(xù)筋接骨，共為佐藥，以增強君藥之補腎強筋、化瘀止痛之功效；黃芪補氣、當歸補血，方藥組成合理，針對性強，能達補腎壯筋骨，促進骨愈合，防治骨壞死之功。成骨性細胞“成骨”、血管內皮細胞“成血管”及VEGF軸對成骨性細胞和血管內皮細胞的調控作用使之達到一個平衡來維持骨的發(fā)育與重建[22-26]，由此我們推斷股骨頭壞死與成骨-成血管偶聯(lián)內在之間存在某種對應的聯(lián)系。

通過本次實驗研究我們發(fā)現(xiàn)激素可同時降低SD大鼠血清中VEGF、BALP、BGP含量，影響股骨頭壞死組織的自身修復，而骨復生能同時升高SANFH大鼠血清中VEGF、BALP、BGP表達的含量，增強成骨-成血管偶聯(lián)調控因子含量的表達，達成“成骨→活血生骨方→成血管”的微循環(huán)平衡，改善股骨頭局部血管內環(huán)境[27-30]，促進SD大鼠股骨頭壞死骨修復及股骨頭新生骨的生成，且隨著治療時間的延長作用越強。